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PCR-SSCP标记技术

更新:2015年03月14日 阅读次数: 【字体:

实验试剂

丙烯酰胺 TBE 变性剂石蜡油乙醇冰醋酸 AgNO3 NaCO1Kb Mark  taq酶相应引物 dNTP等

实验步骤

 在小于1Kb长度的情况下,DNA片段长度与丙烯酰胺的浓度选择如下:

DNA片段长度(核苷酸数)

丙烯酰胺(%)

1Kb~700b

3.5

700b~500b

5

500b~200b

8

200b

12

在进行SSCP前首先要通过PCR扩增出特异性好的产物(琼脂糖电泳不能有过强的拖尾)。

  

  1.制备聚丙烯酰胺凝胶(PAG)

  按上表制所需的胶液,将梳子插入模子,从梳子一端加入胶,当胶液快到梳齿时,使模子向加胶端倾斜,继续慢慢加胶,边加边放端模子以防止气泡形成,室温放置1h使 之凝固.然后拔掉梳子,顶部加入1×TBE封闭,备用.

  2.电泳

  取10μlPCR产物,加入10μl变性剂(95%甲酰胺,10mmol/LEDTA,0.02%溴酚蓝)、30μl 石蜡油,煮沸5min,取出立刻放入冰浴中2min以上,然后将水相全部上样,10-15℃下 电泳.开始在300V电压下电泳5min,然后在120V电泳8h,取下凝胶,将其浸在含 0.5ug/ml溴化锭的1×TBE缓冲液中染色30--45min,在紫外灯下观察,或进行银染.

  3.银染法

  将PAG板用去离子水洗二次,浸入10%乙醇和0.5%冰醋酸溶液固定6min.用去离子水洗二次,再浸入0.2%AgNO3溶液中10min.用去离子水洗3--5次,然后浸入1.5%NaOH和 0.4%甲醛溶液中显色7min.最后,用0.75%NaCO3终止显色.

注意事项

SSCP是一种快速、简便、灵敏的检测基因突变的方法,为了使SSCP达到最佳效果,应 注意下列事项.

  ①重复性.影响SSCP重复性的主要因素为电泳的电压和温度.这两个条件保持不变, SSCP图谱可保持良好的重复性.一般SSCP图谱是二条单链DNA带,但有时有的DNA片段 可能只呈现一条SSDNA带,或者三条以上,这主要是由于两条单链DNA之间存在相似的 立体构象.有时三条以上的SSCP图谱是由于野型DNA片段和突变型DNA片段共同存在的 结果.

  ②靶DNA序列长度的影响在实验中发现SSCP对短链DNA或RNA的点突变检出率要比长链 的高,这可能是由于长链DNA和RNA分子中单个碱基的改变在维持立体构象中起的作用 较小的缘故.而有人认为在DNA链较短的(400bp以下)情况下,DNA的长度不会影响SSCP 的效果.他们仔细选择了实验条件,发现354bp的DNA中点突变的检出率仍可达到90%以 上.

  ③电泳电压和温度的影响:为了使单链DNA保持一定的稳定立体构象,SSCP应在较低温度下进行(一般4℃-15℃之间).在电泳过程中除环境温度外,电压过高也是引起温度升高的主要原因,因此,在没有冷却装置的电泳槽上进行SSCP时,开始的5min应用较高的电压(250V),以后用100V左右电压进行电泳.这主要是由于开始的高电压可以使不同立体构象的单链DNA初步分离,而凝胶的温度不会升高.随后的低电压电泳可以使之进一步分离.在实验中应根据具体实验条件确定电泳电压.

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