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中生网 > 实验技术 > PCR技术 > 引物设计 > Oligo 6 引物评价分析

Oligo 6 引物评价分析

更新:2010年03月15日 阅读次数: 【字体:

1、打开oligo 6。
2、单击file菜单再点open或点击“打开”快捷图标或者用快捷键“Ctrl+O”可弹出一对话框,然后选择基因序列。点击“accept”,出现三个窗口。
3、点击“window”再点击Tile,出现以下三个窗口,三个指标分别为Tm、△G 和Frq,因为分析要涉及多个指标,起动窗口的cascade排列方式不太方便,可从windows 菜单改为tile方式。如果觉得太拥挤,可去掉一个指标。 △G值反映了序列与模板的结合强度,最好引物的△G值在5’端和中间值比较高,而 3’端相对低。 Tm值曲线以选取72°C附近为佳,5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应。 Frq曲线为“Oligo 6”新引进的一个指标,揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时,宜选用3’端Frq值相对较低的片段。
4、在设计时,可依据图上三种指标的信息选取序列,如果觉得合适,可点击Tm图块上左下角的Upper按钮,选好上游引物,此时该按钮变成红色,表示上游引物已选取好。下游引物的选取步骤基本同上,只是按钮变成Lower。
5、上下游引物全选好以后,需要对引物进行评价。可以用“Analyse”菜单分析你的引物,比如有无引物二聚体、发卡结构等等。首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体行成的可能性。需要注意的是引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成,也有可能是在上下游引物之间形成(cross dimer)。二聚体形成的能值越高,越不符台要求。 一般的检测(非克隆)性PCR对引物位置、产物大小要求较低,因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构(hairpin);与二聚体相同, 发夹结构的能值越低越好。一般来说,这两项结构的能值以不超过4.5为好。当然,在设计克隆目的的PCR引物时,引物两端一般都添加酶切位点,必然存在发夹结构,而且能值不会太低。这种PCR需要通过灵活调控退火温度以达到最好效热果,对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。第三项检查为GC含量,以45.55%为宜。有一些模板本身的GC含量偏低或偏高,导致引物的GC含量不能被控制在上述范围内,这时应尽量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近,以有利于退火温度的选择。
6、当我们结束以上三项检测,按“Key Info”弹出一窗口,其中总结性地显示该引物的位置、产物大小、Tm值等参数,最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。

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关键词:Oligo 引物
相关栏目:PCR技术 引物设计
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