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中生网 > 实验技术 > PCR技术 > 引物设计 > 用于RACE引物设计的原则

用于RACE引物设计的原则

更新:2010年06月02日 阅读次数: 【字体:

引物设计的优劣对于做RACE是至关重要的,如果引物的特异性不好,就会给实验带来许多麻烦,甚至扩增不到我们这实验预期想的目的产物。以下是结合一些网上的资料和我们在多次实验中总结出的引物设计的原则。

兼并引物的设计

用兼并引物扩增,一般是我们想克隆的物种中没有我们想要克隆的目的基因的信息,但在其它物种中是存在的,我们就可以将其它物种该基因的序列进行序列同源性比较,同源性高的区域就是兼并引物设计的侯选区;或是假如这些基因的核酸序列的同源性不高,没有合适的选择区域,则我们可以用将其它物种该基因的序列翻译成氨基酸序列,然后进行序列同源性比较,同源性高的区域一般是保守区,再用保守区氨基酸对应的核酸序列设计兼并引物,但兼并引物兼并度(即单条引物上各兼并碱基之和的乘积)应小于1000 ,且兼并引物的3’端应尽量减少兼并性,并使3’端最后6个碱基的G或C的含量大于50%,以提高特异性;此外,假如我们只知道氨基酸序列,则可根据不同物种密码子的偏好性来设计引物。

有部分碱基序列的引物设计

对于用差异显示(Differential Display Reverse Tranion ,DDRT)或者抑制减法杂交(Suppressive Subtractive Hybridization ,SSH)、RNA指纹、EST芯片及兼并引物扩增等方法得到DNA片断,要克隆全长cDNA,或者用同源序列克隆其他物种中的同源基因,3'端的扩增一般都不成问题,难就难在5'端的片断扩增。利用SMART技术将SMART引物自动加入cDNA的5'端,不但能避免加接头或者加一串碱基的麻烦,而且能得到全长的cDNA 5'端。只要少至25个碱基的已知序列即可克隆出全长的cDNA[4]。

如你欲克隆的基因在GenBank已列出的26种生物中,且是多基因家族的一个成员,则应先上网进行BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST),为了提高扩增的特异性,应选择没有同源性的区域设计引物。基因特异性引物(gene special primer,GSP)和套式引物 (nested primer,NP)的长度以23~28个碱基为宜,GC含量50%以上,且GSP的5’端6个碱基与UPM两条引物的3’端互补碱基应<4,NP的5’端6个碱基与NUP的3’端的互补碱基应<4,如果不这样的话,会影响扩增效率,这是因为PCR扩增的关键在3’端的特异性。

但如果是多基因家族的,且已知的信息有限,用RACE的产物可能出现多条带,这不要紧,先将电泳后的胶上的条带转到尼龙膜上,可在EST序列中克隆一DNA片段,用32P-dCTP标记,Southern印迹法,即可鉴定出来。

需要声明的一点是,做RACE的引物与扩增已知序列的引物设计有所不同,5’RACE的GSP和NP引物为cDNA上的序列,3’RACE的GSP和NP引物为与cDNA反向互补的序列。用软件或经验公式提供的退火温度只是一个参考值,在具体操作中要灵活多变。

反转录5’

cDNA的获得:5’CDS (5'–(T)25N-1N–3'N = A, C, G, or T; N-1 = A, G, or C) 1μl Total RNA 2μl SMART A oligo Ⅱ(5'–AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACGCGGG–3') 1μl ,ddH2O 1μl 混匀后,稍加离心,EP管用封口膜封好后,浸没于70℃水浴2min,置冰上2min。加入以下药品:5×First-Strand Buffer (250 mM Tris-HCl (pH 8.3)375 mM KCl 30 mM MgCl2) 2μl ,Power Reverse Tranase (CLONTECH公司)或MMLV Reverse Tranase 1μl,dNTP(RNase  DNase Protase Free) 1μl, DTT(RNase  DNase Protase Free) 1μl,  混匀后,稍加离心,EP管用封口膜封好后, 浸没于42℃水浴90min。加90μl TE  Buffer或ddH2O,于72℃水浴7min,以灭活反转录酶。

PCR反应条件的优化 

PCR反应条件的优化,无非是从如下几方面考虑:引物与模板的浓度是否匹配,退火温度是否合适,Mg2+浓度(提高Mg2+浓度,可使引物二聚体的亮度减弱)等等。限于篇幅,不作展开讨论,向大家推荐两个网站(http://www.pebiodocs.com/pebiodocs/00101795.pdfhttp://www.qiagen.com/literature/qiagennews/0297/972pcrop.pdf),其上有详细的说明。

讨论与展望

以上是我们结合多种试剂盒的说明书和一些网上查到资料整理成文,并加入了我们在实际操作中行之有效的方法。引物设计,当然,可以用软件,用于RACE引物设计的原则,是按照我们实验室惯用的方法写成。上面提到的RNA提取的方法经过我们实验室多人的验证,因此,对于高等植物我们认为是比较合适的;但此方法没有在动物和菌类中验证过,其实,对于其它生物RNA的提取可以根据此方法稍加改进,一般来说只要操作得当,应该可以提出高质量的RNA。PCR反应条件的优化,是建立在引物设计特异性强和高质量的RNA上的,一般来说,前面两个环节没出问题,只要用质量较好的DNA聚合酶,克隆出全长cDNA志在必得。当然,时代在发展,人类在进步。相信在不远的将来会的更高效、更快捷的方法出现。

关键词:引物设计
相关栏目:PCR技术 引物设计
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