那就用盐酸胍或者脲洗看看,也许变性沉淀了, 用通常的方法也许洗不下来. 也可以加点蛋白酶试试.
24)分子量700的化合物应该选择G-10 或G-15 ,如果是离子型的或用离子型交换剂可以除去杂质的话就用QAE 或DEAE, 不过工业生产建议用G,因为QAE或DEAE体积受酸碱及离子强度变化太大.
小分子物质最好别用凝胶过滤去分离,估计没有什么效果,除非是和很大分子的分离还可以,带电荷那就选离子交换,也可以选择反相
25)您好，我有一个非常头疼的问题请教：现在在装一根XK1.6cmx100cm长的superdex prep grad 75柱，系统使用的是AKTApurify100，用装柱器一次性装入胶体，柱效测得8850N/m，低于10000N/m的要求，但是由于流速1ml/min时压力逐渐升高我将在线滤器卸下，压力降低后再测柱效为何变成了5500N/m？还想问问您装柱头时是否不能压得过紧？技术支持说这样会导致峰前倾，我在最大流速3ml/min冲了1小时后将柱头压下6mm，测得的对称因子是1.75，低于0.3-1.3的要求，请问是否是因为我压胶过紧？
还想问问您装这种极细长的凝胶柱除了将胶一次性倒入外到底还有哪些因素影响柱效？问了技术支持说没别的就得一遍遍装，逮到哪次算哪次，真是这样吗？柱子太大流速太慢，从装好到测完柱效要2、3天，所以急盼您的指点，非常感谢！
我觉得测定柱效是其中的一个方面,最重要的是跑个样品试试看,我觉得你装柱子的一个问题是在一次倒入填料后应该用最大流速去过柱子,等压力平稳后,你把柱子的转换头接上压紧,这样再用低于你最大流速的来操作,压力不会升高,柱床也不会变化,其实对于压紧的柱子也不一定需要重装, 你可以反冲, 这样压力一般就会平稳, 别太迷信柱效测定, 因为还是有误差的,如果装完的柱子柱子前后效率差这么多,那这个填料就不好用,但是填料本身应该没有问题,所以说不应该太相信这个东西, 我一般装完柱子根本不测柱效, 一样用,此外我觉得纯化也别过分依赖凝胶过滤, 装柱子时间长, 而费时间也长, 上样量也少, 其实成本很高,效率却不一定高. 能用别的方法就别用这个方法.
如果峰型不对称,那你要柱子中填料的面一定要平,这样才能保证你的峰型好.
26)我的蛋白酶分子量可能在300KD以上，可以用
可以用Sephadex G-25 Fine去除其中的盐份吗？
应该没有问题,蛋白不会沉淀或者过不了柱子的,它可以从填料的缝隙中过去,别担心,一样能用,如果不放心,那也可以用G50,你先试试就知道了.
27)我正在做蛋白活性的分析，需用空载体PET28B-HIS 蛋白作为空对照，但是它太小了怎样才能得到呢?
抱歉,我不是做上游的,我觉得你可以随便找一个带his标签蛋白,它肯定没有你目标蛋白的活性,这样做对照就可以了.
28)现有一个困扰我多时的问题向您请教。我们的蛋白以包涵体形式在E.coli中表达，利用SP-sepharose FF纯化时，在梯度10%-100%都有目的蛋白被洗脱。请问您是否遇到过这种情况，据您考虑这是什么原因。非常感谢。
这个我没有做过，我觉得变性条件下蛋白特性和普通不一样也许造成这样的结果，你可以参考包涵体清洗，那样就可以得到比较纯的蛋白，我觉得在变性条件下，非亲和的方法很难做好纯化．
29)神经细胞膜N－甲基－D－天冬氨酸受体蛋白纯化的技术路线及关键点的指导，有功能活性，量少就可以，105KD的复合蛋白，用抗体结合柱子是否需要抗体量很大？
洗耳恭听！
抗体肯定需要很多的，一般每ml偶联抗体应该在１０－２０mg，那需要２０－３０mg抗体，抗体也不便宜，你这样不如直接把N－甲基－D－天冬氨酸或者天冬氨酸偶联到填料上做成亲和填料，然后用这两物质竞争洗脱也许更好一点．你可以试试，如果天冬氨酸可以那就更简单，我们公司可以帮你合成，或者提供活化好的介质自己偶联．
30)我现在用glutathione sepharose 4B纯化原核表达的GST融合蛋白(可溶性的），目的蛋白大小47KD,pI=9.9, 但是纯化后在融合蛋白（73KD）下面60KD左右处有一条含量较多的带，并且在50KD左右,40KD左右,26KD处都有很清晰的带，我裂解细菌时加了PMSF，纯化过程是照说明做的，PBS洗的次数超过说明书的用量，还有一次加了1%的Tritonx-100,用还原型谷胱甘肽洗脱的pH=8.0 ,总共做了三次，但每次结果都一样，目的蛋白只占1/8左右，我的要求也不是很高，最起码也要60%就可了，但为什么那么多杂带呢？很郁闷，请搂主帮帮我，谢谢！
怀疑是降解或者表达后自己降解或者破碎时候条件剧烈而断裂，所以有好几条带，你可以用GST抗体做WB试试，你也而已用不同浓度原型谷胱甘肽洗脱看能不能得到更好的结果．
您说的降解的问题我也考虑过，但是我超声的时候加了PMSF,是不是还需要加别的东西，表达后降解如何避免呢？我用GST 以及目的蛋白做了WB,但我的这两个抗体都是多抗，做出来都有带，特异性不是很好。您说的不同浓度原型谷胱甘肽洗脱，我可以试试。您还有什么建议，请不吝赐教，非常感谢。
别客气,超声如果时间过长或者强度比较大,那也可以使蛋白断裂,杂带增加,所以你可以试试缩短点时间,这种断裂加PMF也没有用.此外由于GST纯化用的填料本身也是有离子交换作用的,因此在缓冲液中适当加0.5M NaCl可以降低非特异吸附,使杂带减少.
我还有一点不明白，您说的（缓冲液中适当加0.5M NaCl），其中缓冲也是指用来平衡柱子的缓冲液吗？还是指超声时的缓冲液？还是洗脱时的缓冲液，对不起，我没有很好的理解您的意思。再次让您费心了。谢谢！
抱歉是我没有说清楚.是平衡缓冲液,洗脱可以不加
我已经照您以上的意见作了，但结果还是一样，请问我该怎么办啊？求求您帮帮我！
那也许本身你表达出来已经降解或者象他们说的非完全表达,那这样是上游的问题,所以最好是能确定问题出在哪里.实在不行没有办法从上游解决,亲和一步也解决不了.你只好用离子交换,凝胶过滤或者疏水做进一步纯化.
31)我的物质也是个小分子,分子量800左右的一个修饰过的肽.用凝胶过滤除不去带色杂质,用QAE 或DEAE就去除的很好,可是带色的杂质在柱子上就洗不下来了.
那可以用低浓度酸碱去洗，应该可以洗下来，如果还洗不下来用５０－７０％的乙醇试试．
32)请问亲和层析样品上柱之后目的蛋白洗脱不下来怎么办？我按照文献上面的方法，用pH4.0，1M NaCL的醋酸缓冲液洗脱，杂蛋白可以洗下来，但是目的酶跑电泳检测和酶活检测都没有，并且平衡缓冲液冲出的杂蛋白也没有目的酶。所以我怀疑是吸附在柱子上没洗掉，又用含10％DMSO的洗脱液洗，还是没有。请帮忙指点一下该怎么办？
用更高浓度的盐,更低pH试试,此外也可以用一点变性剂如1-2M脲试试,加DMSO要小心变性蛋白沉淀
33)我是一个新手,刚开始做RP-HPLC纯化蛋白.我想请教一下
1.进样峰大是什么原因呢?尽管进样前已用约10-15倍柱体积的5%bufferA(0.1%TFA)去平衡柱子了.
2.用vydac c4的柱子纯化lysozyme标准品(SIGMA),上样量为100ug时总有多个峰,改为30ug时就只剩下一个峰;但将浓度梯度放缓,上样量为100ug时也只有一个峰.这是为什么呢?
谢谢!
我没有做过几次HPLC分析蛋白,进样峰大也许还是样品本身的问题,你可以直接用缓冲液或者水试试,看看是不是也这样.
后面的问题我不明白浓度梯度放缓,上样量为100ug时也只有一个峰是什么意思,是洗脱梯度吧,我想如果是这样,那也许是上样浓度过高,而你的洗脱有机溶剂浓度高溶解不好吧,仅供参考
34)请教chromatography大哥, 我欲纯化精浆蛋白(前列腺特异抗原),前面的同仁最初试过从精液中提取纯化,但据说跑出来的带分子量不对,请问这是怎麽回事?谢谢!
我不知道在哪里看过这个蛋白的纯化,好象是用亲和的方法,分子量不对差多少,仅靠分子量是不行的,最好有活性测定的方法.
35)请教chromatography兄，我欲纯化一个分子量16K的蛋白，pI5.5-6.0,为什么很多文献中提到的纯化方法是用阳离子柱，缓冲液pH7.0,那样的话，蛋白不就带负电荷了吗？还有，我用酵母表达该蛋白，试用Q柱纯化时，色素大部分结合到柱上，不知道该怎么办？
用阳柱是不是主要去杂质的，色素不和你蛋白下来没有关系，最后可以用00.5MNaOH+2MNaCl洗看能不能洗掉。
36)还有个问题就是我做的工作是将鼠抗体人源化,肯定要用到大量抗原来筛库,前面人纯化的精浆蛋白是不够的,有人告诉我将剩下的精浆蛋白在原核中表达,会比从前列腺组织块中提取快,而且量也多,但有人说这样复杂,时间也长,我不知究竟该如何?请赐教!
我觉得如果在前列腺组织块含量高就不需要表达，如果不高那就表达，但是我觉得最简单的方法还是提取，毕竟表达也天然的蛋白有时候是不一样的，何况也不是所有的表达都好做，所以我觉得能提取还是提取的好。
37)请教chromatography兄，我是一个新手，欲纯化一个嗜盐性的酶，该酶至少需1M的Nacl才能有活性，请问我该如何设计纯化方案？
那只好用疏水了，我记得当初中科院微生物所的我的校友用的就是我们的苯基琼脂糖凝胶，硫酸铵沉淀，过疏水．
38)我的（101kd）在上清中我已把它纯化，但有条杂带（30kd），请问我如何去掉杂带？如果用DEAE-52层析柱，我容蛋白的buffer(50mMNaH2po4 100mMNacl 250mMimidalole)，Nacl浓度是不是太高了，如何处理？
我要做分子筛，针对线粒体蛋白，能给我一些建议吗？贵公司能否提供？谢谢。
最好优化你的纯化条件，没有必要再去做别的纯化，实在没有办法再做，否则浪费时间不说就怕效果也不一定好，何况凝胶过滤处理量很小，不知道你用的什么方法纯化的，线粒体蛋白分子量有多大，杂质有多大．线粒体蛋白有什么特性．
39)我有一个GST融合蛋白，分子量大概60KD，经亲和层析纯化后，SDS电泳检测，有3条主要的蛋白带（也有其他的杂蛋白带），最浓的是我得目的蛋白，但是另外两条带的浓度也很大，这两条带的大小加起来差不多是目的蛋白的大小。试了两次都这样。我想请问这到底怎么回事？是目的蛋白降解的还是其他的杂蛋白？如果是降解的，如何确定？为什么亲和纯化效果会这么差那？
我是蛋白领域的生手，正在为这个问题困扰不安，正好发现了chromatography 的帖子，请多指教！我已经在这个问题上折腾了很长时间了，所以很着急，能不能帮我想想办法？谢谢！
怀疑是降解，你查查以前的帖子，你用GST抗体WB做看看有几条，如果还是三条那是降解，如果不是，那就没有，在纯化的平衡缓冲液中加0.5M盐，看能不能去掉杂带，此外可以用不同浓度的GSH洗脱试试，破碎的时候超声别太强，时间别太长。也可以加点酶抑制剂试试
40)我使用的蛋白纯化系统使AKTApurify100，刚刚在用superloop进样时不小心把进样方式设成了system pump进样，结果成了A2泵进样，而由于这台机器长期没有人使用了，A2吸头所在的溶液中长菌，管路中有气泡，进样后导致系统压力增加一倍，请问是否是菌体堵塞柱头所至，另外如柱子里有气泡的话有什么可见的表现形式？是否压力上下跳动不稳？我用的是自己填装的SUPERDEX75，柱子使XK1.6x100cm，压力现在在0.13-0.15兆帕间不停跳动（原来是0.6兆帕），这正常否？另外，我现在的流动相是PBS，是否可以直接换成20%乙醇将柱子反过来冲？盼指点，谢谢
我觉得如果你的A2输液管由于堵塞，才会造成你说的这样压力不稳定，如果真的是进空气或者堵了，那你的柱子后面应该没有液体流出来，所以关键是先把A2输液管的头清洗，然后用20%乙醇作为溶液，再用排气用的注射器抽掉空气，然后再清洗泵，这样就可以，柱子里面应该没有空气，所以和柱子无关。我推断你A2管道中有空气，根本进不了液体，所以应该没有关系，按我说的去处理，应该就可以。
谢谢你的回复，但我只是进样方式设置成了A2泵进样，进样完成后还是A1泵恒流速泵入流动相，而A1泵的吸头和整个管路都是干净的，这时压力仍然是0.15MPa，而且今天早上已经上升到了0.17MPa（装完柱子测柱效时是0.06MPa），这是否意味着柱头有堵塞但未完全堵死？
最好清洗一下A泵，这样也许好点，此外你最好用A2输液管清洗，压力其实是有波动的，没有关系。当然为避免有东西进柱子，你也可以倒冲一下柱子，压力也随液体的黏度不同而变化，所以有时候压力不高也不一定说明堵，例如水的黏度要大于20%的乙醇，你装柱用的是20%乙醇，自然压力小，而用缓冲液压力要比装柱高也是正常的，只要不是一直往上升高就没有问题。
装柱后一直是用水平衡的，压力在0.08MPa，准备进样时换用PBS，因有少量盐导致压力降低到0.06MPa，可自从A2进样后压力就是0.14MPa左右的样子了，我已经将柱子反冲。
那就好，只要压力恒定，一般没有什么问题。
41)1.我买了25mg RNase A，要求在4摄氏度下贮存，我想取出10mg，当拿出冰箱时，会有水汽马上附着于瓶上及药品上，药品都被吸潮了。有同学建议我等放置到室温下再取用。我该怎样取用？我怎样称量？药品在小瓶里看起来太少了，怎样取出来，那瓶是带盖的小瓶吗？
2.我用RNase A 偶联Sepherose 6B，要求在4摄氏度下搅拌20小时，很难实现，有没有好办法？在冰箱里放不进去搅拌器。我想用冰块冷却，然后放在水平的那种摇床行吗？
3.提取过程也要求在4摄氏度下进行，用冰一直冷却缓冲液行吗？
4.资料上要求用Sepherose 4B，老板说以前买了Sepherose 6B，不让买Sepherose 4B，我要纯化的蛋白大约是50k，这可行吗？有什么影响，偶联的条件需要调整吗？
5.给我详细介绍一下偶联的注意事项好吗？
6.我用WHATMAN的DE52做预纯化，每次用完以后用含 2M NaCl 的tris缓冲液冲平后在进行下次使用可以吗？我的意思是每次使用后用不用NaOH和HCl再生？是不是上次用完后冲平就可以下次使用，当使用不同的缓冲液时才可以？我每次都用的都是相同的缓冲液。
1. 放到室温是不错的做法，但是10mg太少了，很难做1ml的填料吧。取的话用一个硬纸条对折，用这样代替药勺应该可以，要不就找掏耳朵用的小勺：）。
2. 实在不行室温也可以，但是要pH别太高。是溴化氰活化吗。
3. 提取那可以在冰浴可以。
4. 6B也没有问题，差不多。
5. 偶联只要注意你偶联物质的稳定性，保证偶联的物质有活性就可以。
6. 用完最好用NaOH再生完，再水冲，保存在你的保存液体中，这样可以保证下次性能相同，如果不洗怕有吸附蛋白影响填料的载量
42)我是一位新成员，也是搞蛋白分离纯化与复性的。我干了一年多，感觉很难，没想到您做起来是这么的轻松，很是佩服。我是在读硕士，想要考博士，还想继续这方面的研究，您能给我推荐一些这方面的导师和学校吗？还有，这个专业的前景如何，还想要请您指点一下。
其实复性是比较难,我做得不多,纯化也许我的运气要好点,而且关键是我们的填料很多,要什么都有,所以好办,此外我们也可以自己合成,所以不存在填料的限制.柱子也各种都有,导师我觉得你可以考虑中科院过程所生物工程国家重点实验室苏志国教授,我在那里工作过,觉得环境还不错,别的地方我也不熟悉,我觉得纯化还是有前途的.只能提供这些消息.
43)我用携基因的真核载体转染293T细胞，然后收集上清夜，收集蛋白，我的蛋白是糖蛋白，请问一下，怎么浓缩提纯我要得蛋白，前提是保持蛋白的活性，我看了好多书，怎么也不懂，向您请教一下。麻烦您详细回答一下。
浓缩可以直接过离子交换或者亲和,这样不需要浓缩样品,如果你的糖蛋白是葡萄糖残基,那也可以用刀豆球蛋白A琼脂糖亲和柱子去纯化.
44)chromatography兄根据您的经验疏水层析时，样品的盐浓度一般应为多少，
25％饱和度的硫铵够不够，我也知道和纯化的目的蛋白有关，一般情况下是多大的浓度？谢谢啦！
25%也许低一些,通常为保险起见差不多要50%,不同蛋白是不一样的,你先高浓度挂上再说.
45)我做的是从霉菌的发酵液中提取分子量小于是10KD的蛋白质.最好是能在1~2KD之间,我想请教楼主怎样做合适.我的邮件地址是zhouxianjiou@163.com.谢谢!
这样小的多肽最好是用反相色谱去制备,这是最快的方法,如果没有条件,那就先超滤,然后再进一步纯化,方法可以用离子交换,反相,疏水.
46)本人也做过多年纯化，但是很惭愧，经验还是少得很。我目前正在作产品研究，正像你说的那样，确实也是难度很大，我目前最大的问题也是一个酸性蛋白的去热源问题，对你的除热源柱非常感兴趣，请把这方面的资料包括价格给我一份吧。还有，我希望能有34um的敖和介质，不知你们能不能做，PHARMACIA的是太贵了。还有GLUTATHIONE 亲和介质。当然，我使用的介质很多，其他你们有的介质资料也发给我吧。
你别客气,我其实也是和大家交流,共同提高而已, 酸性蛋白去热源和核酸去热源是一样的,都是酸性的物质, 所以想用阴离子交换的方法去是很难的, 我们用我们去内毒素的填料解决了我们核酸去内毒素的问题, 现在有几家药厂用我们的填料, 也解决了困惑他们的热源问题. 至于34um的敖和介质效果和90um的没有什么差别, 没有必要, 我用过200um的都一样用, 亲和的填料对颗粒要求不高, 如果不是用线性洗脱而改用阶段洗脱效果一样很好,这样根本不用考虑可颗粒大小,我把我们的材料发给你一份,希望有所帮助.
47)请问怎么进行SP Sephadex C-25装柱前的预处理，谢谢！
不需要特别处理,其实只要是新的填料直接平衡就可以用.说明书上应该都有.
