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实验技术 > 技术文章 > 对氨基酸离子交换色谱实验方法改进

对氨基酸离子交换色谱实验方法改进

最后更新:2010-1-1 阅读次数: 【字体:
    色谱技术广泛的应用于蛋白质、核酸、多糖、脂类、氨基酸等生物分子的分离和纯化[1],是目前科研上常用的实验技术。由于受实验条件的限制,至今难以在本科生中普及开展。为了提高实验课质量,根据学生实验的特点,我实验室对如何将科研上常用的实验技术转化为学生实验进行了探讨[2-3]。该研究对色谱实验方法进行了必要的改进,通过学生实验,取得了良好的效果。 
  1  材料与方法 
  1.1  实验仪器 
  上海产内径为1.6 cm的上阀和下阀有导管联通的色谱柱、铁支架、胡蝶夹;分光光度计、恒温水浴箱等为共用设备。 
  1.2  实验方法 
①装柱:由于1.6 cm的色谱柱内径较粗,用滴管吸树脂装柱太慢,可用小烧杯将阳离子交换树脂和去离子水搅拌后直接装柱,色谱柱中装树脂的高度为14~16 cm,降低上阀的高度,多余液体即可从联通的导管中流出,直至液面与树脂平行,然后加pH5.3的柠檬酸缓冲液至色谱柱中平衡,用pH试纸测流出的洗脱液 至pH5.3为止; 
②加样:待色谱柱的液面与树脂平面高度相同时,加入氨基酸(天冬氨酸和赖氨酸)混合液0.5ml,然后降低上阀的高度放出0.5 ml液体,使氨基酸混合液进入树脂,以免加pH5.3的柠檬酸缓冲液洗脱时稀释而不利于分离; 
③洗脱和收集:洗脱和收集的速度最重要,收集的速度过快,氨基酸不能得到单一的吸收峰,收集速度过慢、时间过长,学生在规定的时间内不能完成实验,不利于在学生中普及开展。经反复探索洗脱液收集的速度为1ml/min,用刻度试管每管收集4ml,首先用pH5.3的柠檬酸缓冲液洗脱收集1~4管,然后改用pH12的NaOH溶液收集5~12管; 
④定量:另备一组试管,每管吸取0.5ml收集液,置相应的试管中,每管加pH5.3的柠檬酸缓冲液1ml,加茚三酮试剂0.5ml,摇匀,置100 ℃水浴中25 min;取出冷却后,加60%的乙醇3 ml,摇匀后用分光光度计以570 nm波长比色,读取各管吸光度值,以各管吸光度值为纵坐标,以管号为横坐标作图。 
  2  结果 
  天冬氨酸全部收集在第4管,赖氨酸收集在第10管,经比色分析后作图可得两个单一吸收峰。 
  3  讨论 
  本研究根据氨基酸离子交换色谱实验的基本原理,对实验设备、实验方法进行了科学的改革、探索与实践,取得了良好的实验效果。其优点表现在:
①、所用树脂为732型阳离子交换树脂,价格便宜,且可再生后反复使用,降低了实验成本,有利于在学生中广泛开展。
②、装柱速度快,传统的色谱柱内径较细,如装柱 速度过快很容易在色谱柱内产生脱节现象。改进后的色谱柱,可将树脂置小烧杯内以混悬液形式装柱,几分钟即可装好,不产生脱节现象,有利于学生操作。
③、分离氨基酸时洗脱速度快,传统的实验分离氨基酸时洗脱速度为24 ml/h,改进后洗脱速度为60 ml/h,有利于学生在规定的时间内完成实验
④、开展色谱实验不仅仅是提高了实验的档次,使学生掌握了科学的实验方法,更重要的是通过实验使学生体会到,实验条件、实验方法并不是不可改变的,根据所掌握的实验技术和理论知识,对实验条件和实验方法可进行大胆的探索与实践。通过实验既有利于启迪学生的创新思维,又有利于培养学生创新、创造、创业的能力。同时对开展提高型和研究创新型实验也探索了一条新的途径。 
    [参考文献] 
  [1] 蒋秉坤,范钦信主编.临床生物化学及生物化学检验[M].北京:人民卫生出版社,2001,94-95.     
  [2]  孙设宗,王秀云,张红梅.血清蛋白醋酸纤维膜电泳易出现的问题及对策[J].郧阳医学院学报,2005,24(3):183-184.     
  [3] 孙设宗,王生慧,张红梅.冷冻肝酶活性的衰减测定及其应用[J].郧阳医学院学报,2004,23(1):42-43. 
提示:本文对氨基酸离子交换色谱实验方法改进属于技术文章文章,主要介绍离子交换色谱氨基酸方面的知识,内容仅供学习交流与参考,不代表中生网的观点。
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