1 材料与方法
1.1 实验仪器
上海产内径为1.6 cm的上阀和下阀有导管联通的色谱柱、铁支架、胡蝶夹;分光光度计、恒温水浴箱等为共用设备。
1.2 实验方法
①装柱:由于1.6 cm的色谱柱内径较粗,用滴管吸树脂装柱太慢,可用小烧杯将阳离子交换树脂和去离子水搅拌后直接装柱,色谱柱中装树脂的高度为14~16 cm,降低上阀的高度,多余液体即可从联通的导管中流出,直至液面与树脂平行,然后加pH5.3的柠檬酸缓冲液至色谱柱中平衡,用pH试纸测流出的洗脱液 至pH5.3为止;
②加样:待色谱柱的液面与树脂平面高度相同时,加入氨基酸(天冬氨酸和赖氨酸)混合液0.5ml,然后降低上阀的高度放出0.5 ml液体,使氨基酸混合液进入树脂,以免加pH5.3的柠檬酸缓冲液洗脱时稀释而不利于分离;
③洗脱和收集:洗脱和收集的速度最重要,收集的速度过快,氨基酸不能得到单一的吸收峰,收集速度过慢、时间过长,学生在规定的时间内不能完成实验,不利于在学生中普及开展。经反复探索洗脱液收集的速度为1ml/min,用刻度试管每管收集4ml,首先用pH5.3的柠檬酸缓冲液洗脱收集1~4管,然后改用pH12的NaOH溶液收集5~12管;
④定量:另备一组试管,每管吸取0.5ml收集液,置相应的试管中,每管加pH5.3的柠檬酸缓冲液1ml,加茚三酮试剂0.5ml,摇匀,置100 ℃水浴中25 min;取出冷却后,加60%的乙醇3 ml,摇匀后用分光光度计以570 nm波长比色,读取各管吸光度值,以各管吸光度值为纵坐标,以管号为横坐标作图。
2 结果
天冬氨酸全部收集在第4管,赖氨酸收集在第10管,经比色分析后作图可得两个单一吸收峰。
3 讨论
本研究根据氨基酸离子交换色谱实验的基本原理,对实验设备、实验方法进行了科学的改革、探索与实践,取得了良好的实验效果。其优点表现在:
①、所用树脂为732型阳离子交换树脂,价格便宜,且可再生后反复使用,降低了实验成本,有利于在学生中广泛开展。
②、装柱速度快,传统的色谱柱内径较细,如装柱 速度过快很容易在色谱柱内产生脱节现象。改进后的色谱柱,可将树脂置小烧杯内以混悬液形式装柱,几分钟即可装好,不产生脱节现象,有利于学生操作。
③、分离氨基酸时洗脱速度快,传统的实验分离氨基酸时洗脱速度为24 ml/h,改进后洗脱速度为60 ml/h,有利于学生在规定的时间内完成实验。
④、开展色谱实验不仅仅是提高了实验的档次,使学生掌握了科学的实验方法,更重要的是通过实验使学生体会到,实验条件、实验方法并不是不可改变的,根据所掌握的实验技术和理论知识,对实验条件和实验方法可进行大胆的探索与实践。通过实验既有利于启迪学生的创新思维,又有利于培养学生创新、创造、创业的能力。同时对开展提高型和研究创新型实验也探索了一条新的途径。
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