当建立内切酶酶切反应体系时有几个关键因素需要考虑。比如如何在正确的反应体系中，加入适量的DNA、内切酶和缓冲液，就可以获得最佳酶切效果。根据定义，在50μl体系中，1单位的限制性内切酶可以在60分钟内完全切割1μg的底物DNA。上述酶、DNA与总反应体积的比值可以做为建立反应体系的参考数据。但是，目前大多数科研人员会遵循下表中所列的标准反应条件，使用5－10倍的过量酶切割DNA，这样有利于克服由于DNA来源不同、质量和纯度不同而造成的实验失败。
“标准”反应体系
内切酶
•从冰箱取出后请一直置于冰上。
•酶最后加入到反应体系中。
•加入酶之前将反应混合物混匀，可以用移液枪上下吹打或轻弹管壁，然后在离心机中快速离心。切忌振荡混匀！
•当切割超螺旋质粒和琼脂糖包埋DNA时，通常需要超过1unit/μg的酶量以达到完全酶切。
DNA
•避免酚、氯仿、酒精、EDTA、变性剂或过多盐离子的污染。
•甲基化的DNA会抑制某些酶的切割效率。
缓冲液
•使用终浓度为1X的缓冲液。
•根据实验需要加入终浓度为100μg/ml的BSA（1:100稀释）。
•在不需要BSA即可达到最佳活性的酶切反应中如果加入BSA也不会影响酶切效果。
反应总体积
•建议在50μl反应体系中消化1μg底物DNA。
•为避免星号活性，甘油浓度应<5%。
•加入内切酶（贮存于50%甘油中）的量应不超过总体积的10%。
•使用以下技术，内切酶的反应条件可能未达到最佳反应条件：克隆、基因分型、突变检测、基因定位、探针制备、测序和甲基化检测等。
•内切酶贮存液中的添加物（如：甘油和盐）和底物溶液中尚存的残余物（如：盐、EDTA或乙醇）会导致小体积反应体系出现问题。NEB提供了一系列高保真内切酶（方便建立反应体系。下述为小体积反应体系反应指南。
酶切反应体系的选择
反应时间
•标准一小时。
•可加入过量的酶以缩短反应时间，或者使用能够快速酶切的内切酶。
•对于许多酶，都可以用更少单位的酶消化16小时。
终止反应
若消化后的DNA不需要进行后续的实验操作：
•用终止液终止反应【50%甘油、50mMEDTA（pH8.0）和0.05%溴酚蓝（NEB#B7021）】。按每50μl反应体系中加入10μl的比例进行。
若消化后的DNA需要进行后续的实验操作：
•用热失活法。
•利用商业化的离心柱或酚/氯仿抽提去除内切酶。
贮存
•大多数内切酶建议保存在-20℃。只有少数内切酶若贮存时间超过30天建议保存在-70℃。详细的贮存信息请参阅内切酶使用说明书或目录。
•10X反应缓冲液和BSA贮存液也应保存在-20℃。
•不要将BSA直接加入到10X反应缓冲液中再冻存，因为这样BSA会产生沉淀。
稳定性
•在任何情况下，都应尽可能的避免将酶置于高于-20℃的温度下。
对照反应
如果在切割底物DNA时遇到了问题，建议加入以下对照实验：
•没有加入内切酶的实验DNA，以检测DNA制备和反应缓冲液中是否存在污染。
•加入了内切酶的对照DNA（含有多个已知内切酶切割位点的DNA，如LambdaDNA或腺病毒-2DNA），以检测内切酶的活性。
•如果对照DNA能够被切割而实验中的底物DNA不能，可以将这两种DNA混合在一起再进行酶切，以检测实验用的底物DNA中是否存在抑制反应的物质。如果确实存在某种抑制因子（通常为盐、EDTA或酚），则混合之后对照DNA也不能被切割。
注意：由于某些酶与DNA结合的亲和性非常高，所以不能很好地与产物分离。这样在进行琼脂糖凝胶电泳时就会出现弥散现象。若出现这种情况，可以在反应结束后加入终浓度为0.1-0.5%的SDS，带型会更加清晰。
