酶切中的常见问题

问题

原因

解决办法

DNA完全没有被内切酶切割

1) 内切酶失活

标准底物检测酶活性

2) DNA不纯，含有SDS，酚，EDTA等内切酶抑制因子

将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA

3) 条件不适（试剂、温度）

检查反应系统是否最佳

4) DNA酶切位点上的碱基被甲基化

换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新将质粒DNA转化至dcm-，dam-基因型的细菌菌株

5) DNA酶切位点上没有甲基化（如Dpn I）

换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化DNA（如San3A I代替Dpn I)，重新将质粒转至dcm+ dam+菌株中扩增

6) DNA位点上存在其它修饰

将DNA底物与λDAN混匀进行切割验证

7) DNA不存在该酶识别顺序

换用其它的酶切割DNA或过量酶消化进行验证

DNA切割不完全

1) 内切酶活性下降

用5-10倍量过量消化

2) 内切酶稀释不正确

用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶

3) DNA不纯，反应条件不佳

同上

4) 内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存其它修饰

同上

5) 部分DNA溶液粘在管壁上

反应前离心数秒

6) 内切酶溶液粘度大，取样不准

将内切酶稀释，增大取样体积

7) 酶切后DNA粘末端退火

电泳前将样品置65℃保温5-10分钟，取出后置冰浴骤冷

8) 由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性

使用标准反应缓冲液及温度，避免强烈振荡

9) 过度稀释使酶活性降低

适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏

10)反应条件不适

使用最佳反应体系

11)识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序

加大酶量5-10倍

DNA片段数目多于理伦值

1) 内切酶星状活性

检查反应条件：甘油浓度大于12%，盐度过低，Mn2+的存在及酶：DNA值过大均均可导致星状活性，降低酶的用量

2) 其它内切酶污染

用λDNA作底物检查酶切结果

3) 底物中含其它DNA杂质

电泳检查DNA，换用其它酶切，纯化DNA片段

酶切后没有观察到DNA片段的存在

1) DNA定量错误（如RNA含量较高）

用RNA酶A（无DNA酶）100ug/ml消化DNA样，酚抽提后沉淀溶解，定量

2) 在酶切反应液中形成非特异的沉淀

在反应前透析DNA样品或用酒精沉淀二次

内切酶保存期内快速失活

1) 保存温度不合适

内切酶贮藏在含50%甘油的贮藏液中，应在-20℃低温保存

2) 以稀释形式保存

稀释酶液不宜长期存放，应一次使用

3) 贮藏缓冲液不适当

使用厂家推荐的贮藏缓冲液

4) 低蛋白浓度

内切酶与500ug/ml的BSA一起保存

电泳后DNA片段的带型弥散，不均一

1) DNA上结合有蛋白质

电泳前上样液65℃加热5min，并加入0.1%的SDS，酚/氯仿抽提纯化

2) 内切酶中含有DNA外切酶

减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶

酶切后的DNA片段连接效率低

1) 含磷酸盐的浓度高

透析，乙醇沉淀去除磷酸盐

2) 内切酶失活不全或含有ATP酶

延长灭活时间或用酚抽提，乙醇沉淀回收DNA

3) 平末端连接

加大T4 DNA Ligase用量

4) 外切酶污染

减少酶用量，缩短保温时间，酚抽提回收DNA

5) 连接缓冲液不合适

重新配制连接缓冲液