载体
1）载体（vector）：运载外源DNA有效进入受体细胞内的工具。
2）载体同外源DNA在体外重组成DNA重组分子，在进入受体后形成一个复制子，即形成在宿主细胞内能独立进行自我复制的遗传因子。
3）载体应该满足以下几方面的要求：
（1）有许多种限制酶切点，且每种酶的切点只有一个；
（2）外源DNA插入后不影响载体的自我复制，对受体细胞无害；
（3）能接纳尽可能大的外源DNA片段；
（4）有可供选择的标记基因，有利于筛选含重组载体的转化子；
（5）具有促进外源DNA表达的调控区。
4）重组DNA技术中常用载体
质粒、噬菌体λ、柯斯质粒（cosmid）和噬菌体M13
5）受体细胞：大肠杆菌（E.coli）
常用菌株：DH5α,JM109等
6）共同特点：
（1）容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好；
（2）能在大肠杆菌中自主复制；
（3）有可选择的，便于筛选、鉴定的遗传标记；
（4）有供外源DNA插入的位点；
（5）自身体积小，很容易同细菌DNA分开并加以纯化。
质粒
1）质粒（plasmid）：细菌或细胞染色质以外、能自主复制、且与细菌或细胞共生的遗传成分。质粒是染色体（核）以外的独立遗传因子，存在于多种细菌细胞内，控制细胞某些特定的遗传形状。
2）双链环状DNA组成，几乎完全裸露，很少有蛋白质结合。
3）质粒的特点：
（1）染色质外的双链共价闭合环形DNA，大小在2-300kb；
（2）能自主复制，且可随宿主细胞分裂而传给后代；
严密控制型质粒：复制与宿主的繁殖偶联，拷贝数较少
松弛控制型质粒：复制与宿主的繁殖不偶联，拷贝数多
（3）质粒对宿主生存并非必需。
4）用途：常规克隆、原核表达、转基因载体。
5）分子生物学实验中常用质粒的特征：
（1）多拷贝，一个细胞可复制30-50个质粒；
（2）含多个基本基因：复制原点Ori——复制扩增
抗性标记——转化筛选
乳糖操纵子——插入筛选
（4）多克隆位点：外源DNA插入
噬菌体载体
1）噬菌体（phage）：感染细菌的一类病毒。
2）基因组分三个区域：左侧区、中间区（非必需区）、右侧区
3）常用：EMBL系列、λgt系列
4）人工改造的噬菌体载体
（1）设计去除λDNA上的一些限制性酶切点；
（2）在非必需区，替换插入标志基因和多克隆位点。
5）λ噬菌体作载体
（1）插入型载体：容许插入5-7kb外来DNA，如λgt系列；
（2）转换型载体：用外来DNA替代中段。
6）主要用途：构建cDNA文库或基因组文库
柯斯质粒
1）柯斯质粒（cosmid）：由正常质粒的复制序列、标志基因、多克隆位点同λ噬菌体的cos位点构成。
2）插入的外源DNA可大于40kb。
3）重组柯斯质粒像λ噬菌体一样感染大肠杆菌，并进行复制。
4）柯斯质粒作载体的困难：
（1）载体自身连接；
（2）每个载体可能插入多个外源片段；
（3）筛选费时。
5）用途：构建基因组文库
单链噬菌体载体
1）M13是丝状噬菌体，长6.4kb的闭环DNA基因组；
2）当M13进入细菌后，单链DNA转变成双链复制型；
3）M13中除有一段507个核苷酸，其余均与复制有关，可在这一段中插入外源DNA；
4）用途：DNA测序；单链的DNA探针
BAC载体——细菌人造染色体
1）细菌人造染色体：被克隆到细菌中的来自其他物种的大片段DNA，并在宿主细菌中产生大量拷贝。
2）BAC的优点：
（1）易于用电击法转化E.coli（效率比酵母高10-100倍）；
（2）超螺旋环状载体，易于操作；
（3）F’质粒本身所带的基因控制了质粒的复制；
（4）很少发生体内重排。
3）用途：克隆大片段DNA，100-300kb
YAC载体——酵母人造染色体
1）酵母人造染色体：将来自其他物种的较大片段DNA连接到酵母DNA上，在宿主细胞中外来DNA能随着酵母细胞中的其他染色体一起复制。
2）有三种必需成分：着丝粒、端粒和复制起点
（1）着丝粒（CEN）位于染色体中央：接收信号使姐妹染色体分开
（2）端粒（TEL）：防止染色体融合、降解、确保其完整复制
（3）复制起点：DNA复制由起始蛋白与特定DNA序列互作开始
3）用途：克隆大片段DNA，100-200kb
4）主要缺点：
（1）存在高比例的嵌合体，一个克隆含两个不相连的独立片段；
（2）部分克隆子不稳定，转代培养中可能会发生缺失或重排；
（3）难与酵母染色体区分开，因为YAC与酵母染色体有相似结构；
（4）操作时容易发生染色体机械切割。
5）正常酵母人工染色体含有：
（1）四膜虫端粒（tel）
（2）酵母自主复制序列（ARS）
（3）酵母着丝粒（CEN）
（4）酵母选择标记（TRP1、URA1）
表达载体
1）特点：带表达构件——转录和翻译所需的DNA序列
2）大肠杆菌表达载体
启动子——核糖体结合位点——克隆位点——转录终止信号
启动子：trp-lac（tac）启动子、λ噬菌体PL启动子、T7噬菌体启动子
核糖体结合位点（RBS）：起始密码子（ATG）和SD序列
转录终止序列
3）用途：表达外源目的基因，获得重组融合蛋白
大肠杆菌原核细胞表达
1）表达载体：较常用的是具可诱导的T7启动子的表达载体，大部分蛋白可获得表达而且表达量较高 （占细菌总蛋白的25%以上）。
2）寄主菌：细菌染色体上含有噬菌体T7-RNA聚合酶基因，它的启动子为Lac启动子，可被IPTG诱导。
3）融合蛋白：常用6-10组氨酸-融合蛋白，只增加几个氨基酸，对蛋白质结构影响较少。 GST-融合蛋白，选择大肠杆菌偏爱密码子，易表达外源蛋白。融合蛋白有利于表达和纯化。
4）用途：获得融合蛋白，用于抗体制备，生化性质研究等。
植物转化载体
1）用于植物转化的载体有两类：Ti类质粒载体和病毒载体
2）Ti类质粒载体：Agrobacterium tumerfaciens
3）6个功能区：
（1）致癌区（合成生长素和细胞分裂素）
（2）冠瘿碱合成区
（3）冠瘿碱分解区
（4）Ti质粒接合转移区（tra）
（5）毒性区（Vir）
（6）DNA复制区（Rep）
4）植物双元载体：能在E.coli和农杆菌中复制的广谱宿主载体。
（1）复制起点
（2）两个T-DNA边界顺序
（3）各种标记基因
原核选择标记：卡那霉素
植物选择标记：潮霉素
（5）多克隆位点
5）农杆菌：存在一种 T-DNA已丢失的Ti质粒，帮助重组双元质粒上的T-DNA转移到植物细胞中。
