双酶切之后连接失败，可以从如下一个方面考虑。
1.是否真正酶切成功。
包括载体和目的片段。目的片段通常由PCR扩增得到，引物上引入酶切位点和保护碱基，这就涉及到引物的合成问题了和加入保护碱基后的酶切效率。
2.酶切后的末端降解。
有的时候，酶切体系中由于收到核酸外切酶的污染，造成酶切后的产物末端几个碱基降解，这个时候当然连接就会失败了。
3.连接的摩尔比例。
连接的时候，都是分子之间进行连接，分子的最佳摩尔比例是连接效率高的前提条件，通常都会建议目的片段会多一些，3～10：1之间。
4.感受态的转化效率。
不管什么样的克隆实验，转化效率始终都至关重要的，好比编篮子，我们都说编筐结篓全在收口。不管以前的实验做的多好，没有高效率的转化效率，长不出菌落，你是一点责都没有。
