三．应用mRNA差别显示技术分离克隆的目的基因
根据表达特性的差异可将高等真核生物的基因分为两大类：一类叫做看家基因（house-keeping），以其组成型表达模式维持细胞的基本代谢活动；另一类叫做发育调控基因（developmental regulated gene），以其时空特异性表达模式完成个体的正常的生长、发育与分化。
在生物个体发育的不同阶段，或是在不同的组织或细胞中发生的不同基因按时间、空间进行有序的表达方式，叫做基因的差别表达（differential expression），生物的发育与分化、细胞的周期变化、生物体对外界环境压力反应，以及个体的衰老与死亡等所有的生命过程，都可归结于基因的差别表达。
（1） mRNA差别显示的原理
几乎所有的真核基因mRNA分子的3′-端都有一段poly（A）序列，根据这种序列结构特征，P.Liang 等人设计合成了总共12种不同的下游引物，用以反转录mRNA，合成第一链cDNA。这种引物通常叫做3′-端锚定引物，它是由11个或12个连续的脱氧胸苷酸加上两个3′-端锚定脱氧核苷酸组成，并用5′-T11MN或5′-T12MN通式表示。其中M为除了T以外的任何一种核苷酸（即A、G或C），而N则为任何一种核苷酸（即A、G、C或T），故MN共有12种不同的排列组合方式。每一种此类人工合成的寡核苷酸引物，都将能够把总mRNA群体的1/12分子反转录成mRNA-cDNA杂交分子。
由于在这些cDNA群体中，代表某一特定细胞类型或发育阶段的mRNA种的含量是相当低的，所以要把一种只在某一发育阶段或某种细胞类型中表达、而在另一发育阶段或某种细胞类型中不表达的目的基因分离出来，就需要通过PCR扩增。
（2）mRNA差别显示实验的基本过程
mRNA差别显示的基本实验过程如图所示。第一步，从一对处于不同发育阶段（或不同基因型）的细胞群体中分离总mRNA，并以选用3′-端锚定引物作反转录合成第一链cDNA。第二步，用5′-端随机引物和3′-端锚定引物组成的引物对，在加入放射性同位素标记的dNTP的条件下，以第一步反转录产物作模板进行PCR扩增。第三步，将扩增样品加在变性的DNA测序胶中进行电泳分离。经X光底片曝光之后，就可以观察到一对处于不同发育阶段的细胞或一对不同基因型的细胞中，差别表达的mRNA之DNA扩增条带。第四步，将有关的差别表达的DNA条带从测序胶上切割下来，回收其中的DNA片段。第五步，由于胶块中的DNA量非常之少，不能直接用于克隆，所以需要用相同的引物对进行第二次PCR扩增，得到一定数量后，再作重组克隆。第六步，将克隆的特定的DNA分别同基在组DNA及总mRNA作Southern及Northern杂交，甚至直接测序，从中鉴定出可能是目的基因的DNA片段。第七步，以此目的DNA片段作探讨，从cDNA文库或基因组文库中筛选全长的cDNA克隆或基因组克隆。第八步，对筛选出来的阳性克隆进行基因的核苷酸序列结构分析及功能鉴定，以便最终获得差别表达的目的基因。
四．应用表达文库分离克隆的目的基因
将外源的真核基因插入在特殊设计的载体上，使之置于原核信号的控制之下，从而能够在大肠杆菌细胞中正确地转录和转译，并表达出外源蛋白质。这样的克隆载体，特称为表达载体（expression vector）。将cDNA克隆在表达载体上，再导入大肠杆菌寄生细胞，如此便构成了cDNA表达文库。然后通过对蛋白质产物的鉴定，分离克隆的真核目的基因。
在表达文库的筛选中，也是先将平板中的菌落或噬菌斑原位复印到硝酸纤维素滤膜上。如图所示，当培养平板上的噬菌体发育成斑之后，每个斑中都含有大量的由噬菌体产生的融合蛋白质，在复印过程上它们便被转移到滤膜上。使用含有目标蛋白质的抗体（第一抗体）的溶液与滤膜混合保温。经过适当时间之后，抗体便同已经吸附在硝酸纤维素滤膜上的融合蛋白质紧密地结合起来。然后漂洗滤膜除去未结合的抗体，再加入第二抗体或葡萄球菌A蛋白（staphylococcal protein A，SPA），继续与滤膜温育，第二抗体可以是放射性同位素标记的，也可以是同生物素偶合的，或是同某种酶（比如碱性磷酸酶）结合的。通过这些第二抗体同第一抗体间的结合作用，为我们提供了可观察的标记（如放射性标记），用以确定能够表达可被第一抗体特异性识别的目标蛋白质的阳性克隆的位置。最后，将放射性自显影X光底片和原初平板对照，挑取下阳性克隆，并从中分离重组噬菌体DNA进行测序鉴定。
也可以通过测定蛋白质的功能进行筛选，或用放射性同位素标记、带有特定蛋质结合位点的DNA片段作探针筛选cDNA表达文库，从中鉴定出能够表达出与它发生特异性结合的目标蛋白质的阳性克隆。
