寻找miRNA的方法：这里我们简单看一下分子信息学的方法：应用计算机的方法如MirScan来寻找miRNA分子已经在线虫及脊椎动物体内取得了巨大的成功。2004年6月，吳政道在前述的计算机方法的基础上提出一种可以进行高通量筛选miRNA靶位点的方法。用这种方法筛选miRNA的原理：该方法的出发点为前体的发夹状结构及miRNA在物种间的保守性。miRNA基因可能定位于编码蛋白基因的内含子区域（有意义链或反意义链）及远离任何已知基因的基因间区域。一些时候，几个发夹状结构以多顺反子的形式丛集在一起.Uwe Ohler, Chris Burge等人给出了一些可以提高寻找miRNA基因的准确性的一些附加条件：1）上游和下游保守序列的数量；2）候选发夹状结构的上游高度保守的模序的存在。MIT的Bartel and Chris Burge报道了一种可以用来探测miRNA与其作用的靶基因之间的关系的新的计算机的方法——TatgetScan。他们针对已知的每一个miRNA，扫描mRNA的数据库——DNA转译为蛋白的生化信息，搜索与miRNA匹配的片段，然后对miRNA与mRNA的匹配程度评分，推测在三个或以上物种中获得高分的mRNA为该miRNA的靶基因。
| 相同点/联系点 | siRNA | miRNA |
| 长度及特征 | 都约在22nt左右，5’端是磷酸基，3＇端是羟基 | |
| 合成的底物 | miRNA和siRNA合成都是由双链的RNA或RNA前体形成的 | |
| Dicer酶 | 依赖Dicer酶的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer产物的特点 | |
| Argonaute家族蛋白 | 都需要Argonaute家族蛋白参与 | |
| RISC组分 | 二者都是RISC组分，所以其功能界限变得不清晰，如二者在介导沉默机制上有重叠；产生了on target和off target的问题 | |
| 作用方式 | 都可以阻遏靶标基因的翻译，也可以导致mRNA降解，即在转录水平后和翻译水平起作用 | |
| 进化关系 | 可能的两种推论：siRNA是miRNA的补充，miRNA在进化过程中替代了siRNA | |
| 不同点/分歧点 | siRNA | miRNA |
| 机制性质 | 往往是外源引起的，如病毒感染和人工插入dsRNA之后诱导而产生，属于异常情况 | 是生物体自身的一套正常的调控机制 |
| 直接来源 | 长链dsRNA | 发夹状pre-miRNA |
| 分子结构 | siRNA是双链RNA，3‘端有2个非配对碱基，通常为UU | miRNA是单链RNA |
| 对靶RNA特异性 | 较高，一个突变容易引起RNAi沉默效应的改变 | 相对较低，一个突变不影响miRNA的效应 |
| 作用方式 | RNAi途径 | miRNA途径 |
| 生物合成，成熟过程 | 由dsDNA在Dicer酶切割下产生;发生在细胞质中 | pri-miRNA在核内由一种称为Drosha酶处理后成为60nt的带有茎环结构的Precursor miRNAs (pre-miRNAs)；这些pre-miRNAs在转运到细胞核外之后再由Dicer酶进行处理，酶切后成为成熟的miRNAs；发生在细胞核和细胞质中 |
| Argonaute (AGO) 蛋白质 | 各有不同的AGO蛋白质 | 各有不同的AGO蛋白质 |
| 互补性（complementarity） | 一般要求完全互补 | 不完全互补，存在错配现象 |
| RISCs的分子量不同(Martinez and Tuschl, 2004; Martinez et al., 2002; Nykanen et al., 2001; Pham et al., 2004) | siRISCs | miRISCs/miRNP |
| 各自的生物学功能不同 | ⅰ抵抗病毒的防御机制(Pfeffer et al., 2004; Ding et al., 2004)；ⅱ沉默那些过分表达的mRNA；ⅲ保护基因组免受转座子的破坏(Mello and Conte, Jr., 2004; Hannon, 2002; Tabara et al., 1999)-9； | 对有机体的生长发育有重要作用(Rhoades et al., 2002) |
| 重要特性 | 高度特异性 | 高度的保守性、时序性和组织特异性 |
| 作用机制 | 单链的siRNA结合到RISC复合物中，引导复合物与mRNA完全互补，通过其自身的解旋酶活性，解开siRNAs，通过反义siRNA链识别目的mRNA片段，通过内切酶活性切割目的片段，接着再通过细胞外切酶进一步降解目的片段。同时，siRNA也可以阻遏3′UTR具有短片断互补的mRNA的翻译（off target）。 | 成熟的miRNAs则是通过与miRNP核蛋白体复合物结合，识别靶mRNA，并与之发生部分互补，从而阻遏靶mRNA的翻译。在动物中，成熟的单链miRNAs与蛋白质复合物miRNP结合，引导这种复合物通过部分互补结合到mRNA的3′UTR（非编码区域），从而阻遏翻译。除此之外，miRNA也可以切割完全互补的mRNA。 |
| 加工过程 | siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂 | miRNA是不对称加工，miRNA仅是剪切pre-miRNA的一个侧臂，其他部分降解。 |
| 对RNA的影响 | 降解目标mRNA；影响mRNA的稳定性 | 在RNA代谢的各个层面进行调控；与mRNA的稳定性无关 |
| 作用位置 | siRNA可作用于mRNA的任何部位 | miRNA主要作用于靶标基因3´-UTR区 |
| 生物学意义 | siRNA不参与生物生长，是RNAi的产物，原始作用是抑制转座子活性和病毒感染 | miRNA主要在发育过程中起作用，调节内源基因表达 |
RISC介绍
RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex; RISC）的组装是在RNAi和miRNA通路中最为复杂的过程。它涉及到小RNA的生产器（Dicer）；小RNA螺旋结构及相应的RLC组装；解螺旋后对称/不对称的RNA螺旋结构及对应的特异性的AGO蛋白质的招募活动。刚产生的siRNAs和miRNAs都是双链结构，这种双链结构需要解螺旋才能被组装到RISC中发挥作用。组装后的复合物分别称为siRISC和miRISC。通过对链两端的热力学稳定性分析，可以将siRNA分为两大类：对称性siRNAs和非对称性siRNAs。对称性siRNAs有着相同稳定性的末端；从而两条链有着同等结合到RISC中的机会(Schwarz et al., 2003)。与之不同的是，非对称性siRNAs的一端稳定性会比另外一端差些。因为稳定性较差的一端容易解螺旋，因此，偏向性地产生一条链结合到RISC复合物上，这个过程我们称之为“RISCs的非对称性组装(Schwarz et al., 2003; Khvorova et al., 2003)”。不同的AGO蛋白质使得RISCs有着不同的功能，这可能是由AGO蛋白质上PIWI结构域决定的。根据AGO蛋白质的不同，我们将RISCs分成两种：切割型RISC和非切割型RISC。但具体到一个RISC是否切割一个目标mRNA分子，情况就更为复杂些，一般的以下五个方面决定(Tang, 2005)：a）必须是切割型RISC；b）小RNA分子和目标的mRNA的配对情况要达到一定的水平；c）特定生物/组织/细胞中的RISC的切割速率情况（就是说在不同的细胞中是那种形式占据主导地位，是切割还是抑制）；d）小RNA分子的来源背景；e）目标mRNA的特性（数量，更新速率，结构，翻译能力）。
siRNA的生成及作用机制
dsRNA 引起的RNAi 大致可分为3个阶段即启动、剪切、倍增：
1、启动阶段
究发现体内dsRNA 除外源性导入外，可能来源于病毒激活、转座子活化及特异重复序列或其他未知途径。研究证实dsRNA 在体内通过21～23 个核苷酸(nt) 片段即小干扰RNA ( siRNA) 发挥其抑制作用。RNase Ⅲ是为数不多的对长dsRNA 显示特异性的核酸酶，依据区域结构可将其分为3 个类型，其中第3 类以果蝇的CG4792 和线虫的K12H4. 8 为代表，二者在RNA干扰过程中可以将dsRNA 加工成siRNA，现在称此酶为Dicer 酶。人类Dicer 酶是一个接近普通RNase Ⅲ的蛋白，能够结合并剪切不同的dsRNA。其结构主要包括：N 端螺旋酶区、PAZ区、C 端RNase Ⅲ区(由dsRNA 结合区和串联核酸酶Ⅲ区组成) 以及ATP 结合区和DECH 盒。另外，在其他诸如小鼠等生物中也发现类似的Dicer 酶。Dicer 酶在剪切长dsRNA 为siRNA 过程中起了关键性作用。在线虫及其他生物中发现了lin24 和let27，这是2 个单链RNA 分子，其突变失活可影响发育，被称为stRNA (small temporal RNA) 。二者是特异性蛋白编码基因的负性调节因子，可在翻译水平上调节基因表达。成熟stRNA可与mRNA的3’端非编码区结合而阻遏其翻译，并不引起mRNA 降解。
2、效应阶段
Elbashir等在果蝇体外系统中加入合成21～23nt 的siRNA， 使之能有效降解同源mRNA， 而当siRNA 浓度增加到一定阈值时，mRNA 降解程度不再继续增加，提示在果蝇裂解液中含有一定数量RNAi 所需蛋白因子。进一步研究得知RNAi 所需蛋白因子是一种复合物，被称为RNA 诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC) 。RISC 是一种核糖核蛋白，包含有RNA 和蛋白成分。其中的RNA 就是siRNA，其蛋白成分包括AGO22、VIG 和dFXR 以及Dmp68 等，实验证实这些成分是RISC 的一部分且为RNAi 所必需。在剪切过程中siRNA 的结构起了重要作用，具有典型结构的siRNA 较平末端siRNA 更能有效引起RNAi 作用，尤其是3′端外悬的第2 个核苷酸影响siRNA 对靶mRNA 的剪切作用。另外，siRNA 对靶mRNA 剪切具有精确的序列特异性。
3、倍增阶段
以往实验发现仅需少量siRNA 即可引起强烈同源基因表达抑制，因此众多学者推测在RNAi 过程中存在倍增放大机制。有人认为在前述的mRNA剪切过程中产生的21～23nt 片段可能会作为新的siRNA 而继续参与RNAi 过程， 从而使干扰作用放大。这种扩增机制只是一种推测，是否存在尚需进一步的实验研究确定。RNAi 的系统性作用也是其引起人们关注的重要原因，但机制不明。Spankuch Schmitt 等在乳腺癌细胞系、子宫颈癌细胞系、结肠癌细胞系等细胞中成功进行了RNAi 实验，并观察到癌细胞增殖明显减少、凋亡显著增加。Krichevsky 等用合成的siRNA 导入有丝分裂后期的原代神经元中，有效抑制了其内源性基因表达，使应用RNAi 技术研究神经发育及功能调控成为可能;不久前Song 等在小鼠体内进行RNAi 实验，有效抑制了Fas21 基因表达，从而延长了患自身免疫性肝炎小鼠的生命，为进行RNAi 的动物实验奠定了实验基础。随着RNAi 作用机制的进一步明确、应用技术的完善成熟，RNAi 技术必将为人类研究基因功能，以及对癌症等疾病进行基因治疗提供强大武器。
