Northern杂交与Southern杂交很相似。主要区别是被检测对象为RNA，其电泳在变性条件下进行，以去除RNA中的二级结构，保证RNA完全按分子大小分离。变性电泳主要有3种：乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳和羟甲基汞变性电泳。电泳后的琼脂糖凝胶用与Southern转移相同的方法将RNA转移到硝酸纤维素滤膜上，然后与探针杂交。
1、材料：待检测的RNA及制备好的探针。
2、设备：电泳仪，电泳槽，塑料盆，真空烤箱，放射自显影盒，X-光片，杂交袋，硝酸纤维素膜或尼龙膜。
3、试剂：
(1)、20×SSPE：175.3g NaCl， 88.2g柠檬酸钠，溶于800ml水中，用10mol/LNaOH调pH至7.4，定溶到1L。
(2)、其他试剂：与Southern杂交试剂类似，只是所有的试剂均应用DEPC处理。
4、操作步骤：
(1)、RNA经变性电泳完毕后，可立即将乙醛酰RNA转移至硝酸纤维素滤膜上。转移方法与转移DNA的方法相似。
(2)、转移完毕后 ，以6×SSC溶液于室温浸泡此膜5分钟，以除去琼脂糖碎片。
(3)、将该杂交膜夹于两张滤纸中间，用真空烤箱于80℃干燥0.5-2小时。
(4)、用下列两种溶液之一进行预杂交，时间为1-2小时。若于42℃进行，应采用： 50%甲酰胺，5×SSPE，2×Denhardt's试剂，0.1% SDS；若于68℃进行，应采用：6×SSC，2×Denhardt's试剂，0.1% SDS，（注意：BLOTTO不能用于Northern杂交）。
(5)、在预杂交液中加入变性的放射性标记探针，如欲检测低丰度mRNA，所用探针的量至少为0.1μg，其放射性比活度应大于2×108 cpm/分·μg，放在适宜的温度条件下杂交16-24小时。
(6)、用1×SSC、0.1% SDS于室温洗膜20分钟，随后用0.2×SSC、0.1% SDS于68℃洗膜3次，每次20分钟。
(7)、用X光片(Kodak XAR-2或与之相当的产品)进行放射自显影，附加增感屏于-70℃曝光24-48小时。
[注意]
(1)、如果琼脂糖浓度高于1%，或凝胶厚度大于0.5cm，或待分析的RNA大于2.5kb，需用0.05mol/LNaOH浸泡凝胶20分钟，部分水解RNA并提高转移效率。浸泡后用经DEPC处理的水淋洗凝胶，并用20×SSC浸泡凝胶45分钟。然后再转移到滤膜上。
(2)、在步骤(3)的操作中，如果滤膜上含有乙醛酰RNA，杂交前需用20mmol/L Tris·Cl (pH8.0)于65℃洗膜，以除去RNA上的乙二醛分子。
(3)、RNA自凝胶转移至尼龙膜所用方法，与RNA转移至硝酸纤维素滤膜所用方法类似。
(4)、含甲醛的凝胶在RNA转移前需用经DEPC处理的水淋洗数次，以除去甲醛。当使用尼龙膜杂交时注意，有些带正电荷的尼龙膜在碱性溶液中具有固着核酸的能力，需用7.5mmol/LNaOH溶液洗脱琼脂糖中的乙醛酰RNA，同时可部分水解RNA，并提高较长RNA分子(>2.3kb)转移的速度和效率。此外，碱可以除去mRNA分子的乙二醛加合物，免去固定后洗脱的步骤。乙醛酰RNA在碱性条件下转移至带正电荷尼龙膜的操作也按DNA转移的方法进行，但转移缓冲液为7.5mmol/LNaOH，转移结束后(4.5-6.0小时)，尼龙膜需用2×SSC、0.1%SDS淋洗片刻、于室温晾干。
(5)、尼龙膜的不足之处是背景较高，用RNA探针时尤为严重。将滤膜长时间置于高浓度的碱性溶液中，会导致杂交背景明显升高，可通过提高预杂交和杂交步骤中有关阻断试剂的量来予以解决。
(6)、如用中性缓冲液进行RNA转移，转移结束后，将晾干的尼龙膜夹在两张滤纸中间，80℃干烤0.5-2小时，或者254nm波长的紫外线照射尼龙膜带RNA的一面。后一种方法较为繁琐，但却优先使用，因为某些批号的带正电荷的尼龙膜经此处理后，杂交信号可以增强。然而为获得最佳效果，务必确保尼龙膜不被过度照射，适度照射可促进RNA上小部分碱基与尼龙膜表面带正电荷的胺基形成交联结构，而过度照射却使RNA上一部分胸腺嘧啶共价结合于尼龙膜表面，导致杂交信号减弱。
Northern 杂交方案：
1、 在10-20ml预杂交液中68℃温育膜2h。
2、 若使用双链探针，在100℃下加热32P标记的双链DNA 5min，使之变形，然后迅速移至冰水中冷却。
3、 把变性的或单链放射性标记的探针直接加到预杂交液中，在核实的温度下继续温育12-16h。
4、 杂交后，将膜从塑料袋中取出，在室温下迅速转移到含有100=200ml 1*SSC，0.1% SDS的塑料盒内，将盒盖好，置于水平振荡器上，温和振荡10min。
5、 将膜转移至另一含有100-200ml预热至68℃、含0.1% SDS的0.5*SSC的塑料盒中，68℃下温和振荡10min。
6、 重复步骤5，再洗涤至少2次，使68℃下共洗涤3次。
7、 在印迹纸上晾干膜，然后让膜于-70℃下在含增感屏的暗盒内对X线片放射自显影24-28h。此外，也可通过磷图像系统扫面得到膜上的图像。
