中生网|生物技术|生物网址|生物软件|实用工具 |本站导航

生物新闻

-

实验技术

-

软件教程

-

论文考试

-

肿瘤癌症

-

检验知识

-

仪器使用

-

健康知识

中生网 > 实验技术 > 蛋白质技术 > 精心整理SDS-PAGE失败实例综合集锦

精心整理SDS-PAGE失败实例综合集锦

更新:2015年04月25日 阅读次数: 【字体:
师兄发现,最近做 WB 的小伙伴真的不少,为了解决一些小伙伴在WB上遇到困难,师兄专门跑去坛子里,把一些有关 WB的好贴扒拉出来,供你们不时之需,同时也要感谢下我们无私的战友lee800265。那么今天我们就从SDS-GAGE失败案例开始吧。想了解更多实验方法和技巧的同学,可以向我申请微信好友哦,我的微信号:shixiongcoming  。向我申请的时候一定要记得备注你的目的,要不然我可会拒绝你哦。

SDS-PAGE “hall of shame”

如果你能够非常熟练的制备一块完美的凝胶,甚至对它进行改进都十分困难,那么你真的应该值得庆幸!但是如果你不能达到这个水平也不要灰心。所有的优秀的科学家都是从失败中成长起来的,事实上,如果不出错我们就很难学到更多的东西!(我的western blot技术也是从上百次的失败中成熟起来的,这中间我就学到了很多,相对于PCR,我第一次就成功的做出了RT-PCR和重叠延伸PCR,但是对于PCR我能说的真的很少!)这本“失误大全”包括了过去实验室中许多学生包括老师跑的最“烂”的胶,它们代表了人们在跑胶是最容易犯的多种错误(当然这些错误仍在更新之中)。看你自己的胶缺陷也许并不能很好的解决问题,至少不是最完美的解决方式,本文用图例指出你可能在哪一些方面改进你的技术。

评价你的胶找出你的症状并和这个小册子收集的实例比对。每一个例子都配有完整的凝胶图像和与之相对的解释及建议。从这本“失误大全”中你应该能够找到解决你的问题的正确的方法。

第一部分:涂抹痕迹(smears)

涂抹痕迹可能由于多种原因引起,但是最常见的原因是聚丙烯酰胺凝胶倒胶的不均匀或者上样量过大。这块胶倒胶不正确,在上部胶倒入制胶槽之前就已经发生聚合。首先倒入的胶聚合发生的太快了。与其重新倒胶,不如停止倒胶重新准备新的聚丙烯酰胺混合液,然后将新的胶倒入旧胶的上方。但是显然这种连接不是非常牢固。(我推荐重新倒胶,制胶很关键,如果你后续还要做blot,胶没有跑好浪费太多了!)查看全文


第二部分:条带过浅

这个问题可能是由于加样孔成形不佳和/或凝胶加样不认真所致。背景较深而且不均一说明蛋白可能存在于电泳缓冲液中。最有可能原因是由于装置没有正确紧密的装配导致较多的样品溢出加样孔。溢出的样品很可能不会重新溶入形成条带,因为这些蛋白从上层缓冲液的间隔持续进入凝胶。查看全文


第三部分:前端指示剂缺失

为了装置凝胶花了不少功夫,如果停止电泳太晚就太可惜了。因为如果部分前端的指示剂已经跑出凝胶的话就不能确定各个条带相对应的迁移率了。这块胶有一个内部的刻度——也就是跑胶时带上了分子量标准(Marker)。由于条带较平直,任意条带都可以作为参考来确定跑胶的迁移率。查看全文  


第四部分:过早终止电泳

很明显这块胶的指示剂前端位于什么位置。仍有继续电泳的空间可以把条带分得更开以增加分辨率。相对迁移率是为了分析凝胶相同位置上相同大小的蛋白。随着蛋白迁移距离的增加分辨率逐渐增高直到弥散限制了分辨率的继续提高。查看全文

第五部分:混在因素

这个问题的凝胶在整个“失误大全”中到处可见。这是由于分离胶的表面不平所造成的,因此当样品浓缩之后所有的条带都变扭曲的形状。扭曲的条带也可以见于电场的不均一,但是这种条带的扭曲应该是对称的。

 以下是对 [精心整理SDS-PAGE失败实例综合集锦] 的评论,总共:0条评论
中生网-生物软件-生物技术-生物网址-实验技术-本站导航-联系我们-收藏本站
©中生网-提供生物软件免费下载,生物实验Protocol,生物网址导航。
Copyright (C)2005-2015 www.seekbio.com All Rights Reserved.