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定量蛋白质组学的方法学介绍

更新:2015年04月25日 阅读次数: 【字体:

1 背景和意义
从生命活动的直接执行者——蛋白质的角度研究生命现象和规律(特别是疾病防治和病理研究)已成为研究生命科学的主要手段。而这些研究往往离不开对细胞、组织或器官中含有蛋白质种类和表达量的研究。对处不同时期、不同条件下蛋白质表达水平变化的研究,识别功能模块和路径,监控疾病的生物标志物,这些研究都需要对蛋白质进行鉴定和定量。生物质谱技术的出现和不断成熟为蛋白质差异表达分析提供了更可靠、动态范围更广的研究手段。基于质谱技术,科学家们不断开发出新的定量蛋白质组学方法,来了解细胞、组织或生物体的整体蛋白质动力学。

2 方法学介绍
目前较主流的定量蛋白质组学方法有5种,分别是Label-free、iTRAQ、SILAC、MRM(MRMHR)、和SWATH。简述如下:

2.1 ?Label-free
Label-free定量,即非标记的定量蛋白质组学,不需要对比较样本做特定标记处理,只需要比较特定肽段/蛋白在不同样品间的色谱质谱响应信号便可得到样品间蛋白表达量的变化,通常用于分析大规模蛋白鉴定和定量时所产生的质谱数据。
Label-free定量不需要标记处理,操作简单,可以做任意样本的总蛋白质差异定量,但对实验操作的稳定性、重复性要求较高,准确性也较标记定量差。因此,Label-free技术适合于大样本量的定量比较,以及对无法用标记定量实现的实验设计。

2.2? iTRAQ
iTRAQ定量是目前定量蛋白质组学应用最广泛的技术,?该技术的核心原理是多肽标记和定量,将多肽的含量转化为114、115、116和117同位素的含量(或113、114、115、116、117、118、119和121的8标记),从而简化了定量的复杂性,最终通过多肽定量值回归到蛋白的定量值,从而最终测定出不同样本之间蛋白质的差异。
iTRAQ定量不依赖样本,可检测出较低丰度蛋白,胞浆蛋白、膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白等,且定量准确,可同时对8个样本进行分析,并可同时得出鉴定和定量的结果,特别适用于采用多种处理方式或来自多个处理时间的样本的差异蛋白分析。金开瑞质谱平台应用iTRAQ定量技术,可鉴定多达6000种蛋白(以人HepG2为例),重复样品间的蛋白表达量相关性可达到0.95以上。

2.3? SILAC
SILAC定量的基本原理是分别用天然同位素(轻型)或稳定同位素(中性或重型)标记的必需氨基酸取代细胞培养基中相应氨基酸,细胞经5-6个倍增周期后,稳定同位素标记的氨基酸完全掺入到细胞新合成的蛋白质中替代了原有氨基酸。不同标记细胞的裂解蛋白按细胞数或蛋白量等比例混合,经分离、纯化后进行质谱鉴定,根据一级质谱图中两个同位素型肽段的面积比较进行相对定量,属于体内代谢标记法。
SILAC属于体内标记技术,更接近样品真实状态,标记效率高达100%,且标记效果稳定,不仅适合于进行全细胞蛋白分析,还适合于膜蛋白的鉴定和定量,每个样本只需要几十微克的蛋白量。SILAC定量适用于活体培养细胞的分析,对多个样品或同一样品不同条件下全细胞蛋白或亚细胞蛋白进行差异比较。

2.4? MRM和MRMHR
MRM是一种基于已知信息或假定信息设定质谱检测规则,对符合规则的离子进行信号记录,去除大量不符合规则离子信号的干扰,从而得到质谱信息的一种数据获取方式,属于目标蛋白质组。其关键在于首先要能够检测到具有特异性的母离子,然后只将选定的特异性母离子进行碰撞诱导,最后去除其他子离子的干扰,只对选定的特异子离子进行质谱信号的采集。金开瑞依据前人的工作在ABSCIEX的5600-plus 仪器上开发出了MRMHR技术,因为MRMHR采纳了高精度的数据,因此选择Transition更加可信,定量更加准确。

MRMHR技术通过两级离子选择,排除大量干扰离子,使质谱的化学背景降低,目标检测物的信噪比显著提高,从而实现检测的高灵敏度,并具有重现性好、准确度高等特点,特别适合于已知蛋白质序列的蛋白质表达量差异验证,可以检测较低丰度的蛋白,但一次MRM实验只能检测到20个左右的目标蛋白。

2.5 ?SWATH
SWATH是瑞士苏黎世联邦理工学院的Ruedi Aebersold 博士及其团队与AB-SCIEX于2012年联合推出的一项全新的质谱采集模式技术,是MS/MSALL技术的一种扩展。与传统的shot-gun技术相比,SWATH采集模式能够将扫描区间内所有的肽段母离子经过超高速扫描并进行二级碎裂,从而获得完整的肽段信息,是一种真正全景式的、高通量的质谱技术。金开瑞现有的Triple-TOF 5600-plus质谱系统,使SWATH定量具有较高的准确度和动态范围,可检测到蛋白质的丰度差异极大,跨越4个数量级。
应用SWATH采集模式,一次实验即可获得完整的定量与定性结果,无需进行方法优化。它可以采集样品中所有化合物的信息,可以对所有化合物进行追溯、查询和分析。定量方法采用高分辨模式,可以消除干扰,提高选择性,且定量能力可与三重四级杆质谱相媲美,灵敏度和动态范围与SRM分析水平相当。针对亚细胞结构、细菌、真菌、细胞分泌物等样本,SWATH定量的效果非常好。

3 结语
蛋白质组学是对一个细胞或组织所表达的蛋白质进行的系统分析,分析技术包括分离蛋白质和肽的分离科学、识别和定量分析物的分析科学和数据管理和分析的生物信息学,质谱是其关键性分析工具。同样的技术现在已经被作为普遍的发现工具来动态检测一个细胞或组织对外来或内部干扰反应而在蛋白质组中的改变,即定量蛋白质组学。针对不同的样本,不同的实验分析目的,可选择不同的定量分析技术。
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