蛋白质纯化实验完全手册

最后更新：2010-6-8 阅读次数： 【字体：小 中 大】

第一章 外源基因在大肠杆菌中的表达

一、通过聚合酶链式反应（PCR）将靶基因亚克隆到质粒载体上

（一）PCR 引物设计的基本原则与 PCR 反应组分和条件 

1.  PCR 引物设计的基本原则

（1）引物与靶基因间配对的碱基一般为 15­20。

（2）引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物 G + C含量宜在 45­55%左右。

（3）引物内部不应形成二级结构，两个引物之间尤其在 3’末端不应有互补链存在。

（4）引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性。可用计算机进行辅助检索分析。

（5）引物 3’末端一般以单个 C或 G结尾。 

2.  PCR 反应组分和条件 

PCR 反应体系一般选用 50 μl体积，其中含有： 

10×Reaction buffer，5 μl 

2 个引物，各 12.5­25 pmol (终浓度各 0.25­0.50 μmol/L) 

4 种底物（dATP + dCTP + dGTP + dTTP），各 200μmol/L 

模板 DNA，100 ng左右 

Taq DNA 聚合酶，2.5­3 U 

PCR 反应条件一般为：

（1）94℃，5分钟

（2）94℃变性 30­60 秒

（3）50­55℃退火 30­60秒

（4）70­72℃延伸 30­60秒

（5）72℃ ­10分钟 5 

共进行 25­35次循环。循环是步骤（2）和（4） 

(二)   质粒 DNA的小量制备

1、传统方法

（1）用灭菌牙签挑单菌落于 3 ml LB 培养液中，37℃培养过夜。

（2）在每个 EP管中倒入 1 ml 左右的过夜培养物，6,000 rpm 离心 1分钟以收集菌体。

（3）将菌体重悬于 100 μl 4℃预冷的溶液 I中，并加入 200 μl新配制的溶液 II, 盖紧管口，快速颠倒离心管 6­7次，然后，冰浴 5 分钟。

（4）加 150 μl 4℃预冷的溶液 III, 倒置 5­6次以混合内容物，然后，冰浴 5 分钟。

（5）12,000 rpm 离心 10分钟后，小心吸取上清至另一 EP管中。

（6）加 2倍体积的无水乙醇，振荡混合，并在室温放置 5分钟。

（7）12,000 rpm离心 5分钟后，移去上清，并用 70%乙醇漂洗 DNA沉淀。DNA 沉淀自然干燥，并溶于 20 μl 双蒸水或 1×TE 缓冲液 (10 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0) 中。 

2. Promega 公司 Wizard Plus 小量 DNA纯化方法­离心方案（适用于产品 A1330， A1340，A1460及 A1470）

（1）12,000 rpm离心 1分钟，以沉淀 1­10 ml过夜培养物。

（2）用 250μl Cell Resuspension Solution充分悬浮大肠杆菌细胞。

（3）加 250μl Cell Lysis Solution，倒置 5­6 次混合。

（4）加 10μl Alkaline Protease Solution，倒置 5­6次混合，室温放置 5分钟。

（5）加 350μl Neutralization Solution，倒置 5­6 次混合。

（6）室温，最高转速离心 10分钟，回收上清。

（7）将离心柱插入收集管中。

（8）将上清倒入离心柱中。

（9）室温，最高转速离心 1分钟，倒掉流穿液，将离心柱重新插入收集管中。

（10）加 750μl Wash Solution（加乙醇），最高转速离心 1分钟，倒掉流穿液，将离心柱重新插入收集管中。

（11）重复步骤（10）（用 250μl Wash Solution）。

（12）室温，最高转速离心 2分钟。

（13）将离心柱插入一个无菌的 1.5 ml微量离心管中。

（14）在离心柱中加 50­100μl Nuclease­Free Water，室温，最高转速离心 1分钟。

（15）DNA溶液保存在­20℃备用。 

(三)   质粒 DNA 的中量制备 

1. 在100 ml 含100 μg/ml 氨苄青霉素的LB培养液中加入1 ml pET­15b/Novablue 甘油菌，37℃培养过夜； 

2. 4  , 4,000 rpm离心 10分钟以收集菌体；在菌体用 3 ml 溶液 I (50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris, pH 8.0, 10 mmol/L EDTA, pH 8.0) 充分悬浮后，加入 6 ml 溶液 II (0.2 mol/L NaOH, 1% SDS)，并倒置混合，冰浴 5­10分钟； 

3. 加入 4.5 ml 溶液 III（60ml 5 mol/L 乙酸钾，11.5 ml 冰乙酸和 28.5ml水），轻摇混合，冰浴 10分钟； 

4. 4℃，12,000 rpm 离心 20分钟，小心吸取上清至另一个 50 ml离心管中；加入 0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置 10分钟； 

5. 室温，10,000 rpm离心 10分钟以沉淀 DNA； 

6. 在沉淀用 70%乙醇漂洗，自然干燥，并溶于 0.3 ml 的 TE (10 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0) 缓冲液中，然后转入 EP管中； 

7. 加入等体积的 5 mol/L LiCl, 室温，10,000 rpm离心 10 分钟以沉淀大分子 RNA 分子；

8. 回收上清，加入等体积的异丙醇，室温放置 10 分钟，12,000 rpm 离心 5 分钟以沉淀 DNA； 

9. DNA沉淀用 70%乙醇漂洗，然后，自然干燥； 

10. DNA沉淀溶于 200 μl含 50­100 μg/ml 胰 RNA 酶的 TE缓冲液中，  37℃保温 30 分钟； 

11. 加入等体积的 13% PEG8000/1.6 mol/L NaCl, 室温放置 5 分钟；1 2,000 rpm 离心 10分钟以沉淀 DNA； 

12. 小心移去上清，DNA沉淀溶于 200 μl TE (pH 8.0) 缓冲液中，并用酚­氯仿­异戊醇（25:24:1）抽提一次；小心将上层溶液转移到一个干净的 EP管中，并加入 0.1体积的 3mol/L NaAc (pH 5.2)和 2倍无水乙醇，混匀，­40℃放置 30分钟； 

13. 12,000 rpm 离心 5分钟以沉淀 DNA； NA沉淀用 70%的乙醇漂洗， 然干燥，并溶于 100 μl TE 缓冲液中。最后，用 1%的琼脂糖凝胶电泳对 DNA进行定量和纯度鉴定。