蛋白质纯化实验完全手册

最后更新：2010-6-8 阅读次数： 【字体：小 中 大】

第三章 DNA­蛋白质相互作用研究方法

一、 凝胶迁移率变动实验 (gel shift or electrophoretic mobility shift assay)

凝胶迁移率变动实验又称凝胶滞留法（gel retardation assay）或迁移率改变法（mobility shift assay），是检测 DNA 结合蛋白的一种简单迅速而又灵敏可靠的实验方法。

凝胶迁移率变动实验的基本原理是：当 DNA 结合蛋白与相应的 DNA 片断或寡核苷酸结合而形成 DNA­蛋白质复合物后，使 DNA 片段的分子量及电荷发生改变，因而在聚丙烯酰胺凝胶电泳体系中其电泳迁移率发生改变，通常较游离的 DNA片段的泳动速率慢得多，在放射自显影 X 光胶片上形成一较游离 DNA片断滞后的带型。

（一）DNA 片段的制备 

DNA 片段的长度一般要求在 300 bp 一下。DNA 片断过大，在聚丙烯酰胺凝胶中不易分离，DNA片断泳动速度的轻微改变不易监测到。 

1. 对于 DNA 酶切片段， 用牛小肠碱性磷酸酶 CIAP） 除 DNA片段中的 5΄ 磷酸，具体方案如下：

在 40 μl体系中， 加 1 μl CIAP (0.1 U/μl), 37℃保温 15 分钟，56℃保温 15分钟；再用 CIAP处理一次；用苯酚/氯仿抽提一次，向上清中加入 5 mol/L NaCl至终浓度为 0.2 mol/L, 以及两倍体积无水乙醇，­20℃过夜；12,000 rpm离心 5 分钟以沉淀 DNA。 DNA 溶于双蒸水中。 

2. 对于合成的单链 DNA片断，需要退火，具体方案如下：将两条互补的单链 DNA 片断分别溶解于双蒸水中，在 EP 管中等摩尔数混合后，放入 100℃水中，自然冷却到 37℃以下。

（二）DNA片段的标记 

1.  在一个洁净的 EP管中，分别加入下列组分： 

DNA 片段 5­6 pmol 

T4 多聚核苷酸激酶 10×Buffer  1 μl 

[γ­ P]ATP (3,000 Ci/mmol, 10 μCi/μl)  2 μl 32 

或 [γ­ P]ATP (5,000 Ci/mmol, 10 μCi/μl) 32 3 μl 

加水至总体积为 9 μl

T4 多聚核苷酸激酶（5­10 u/μl） 1 μl 

2. 混匀，37℃保温 10分钟。 

3. 加 1 μl  0.5 mol/L EDTA 终止反应。

（三）游离[γ-³²P]ATP 的去除 

1. 对于小于 18 bp的 DNA 片断，可用 G­25 离心柱去除其中未结合的[γ-³²P]ATP。 

2. 对于大于 18 bp 的 DNA 片断，可用乙醇沉淀的方法去除其中未结合的 [γ-³²P]ATP，具体方案如下：

加0.5倍体积的7.5 mol/L乙酸铵和两倍体积的无水乙醇，­ 0℃放置30分钟；1 ,000 rpm离心 5分钟以沉淀 DNA；DNA溶于 50μl双蒸水中，即为³²P标记的 DNA片断溶液。³²P标记的 DNA片断溶液可放在密闭的铅罐中，并保存在­20℃备用。

（四）迁移率变动实验 

³²P标记DNA片断的量一般为 0.1­1 ng，可根据具体情况适当增减，以能形成清晰的滞后带而游离 DNA带又不过浓为宜；蛋白质的量为 0.1­10 μg，应进行预实验摸索出适宜的蛋白质加入量。以能形成清晰的滞后带，而又有适量的游离 DNA带残存为宜。 

1. 在无菌的 EP管中建立下列反应：

反应 1（负对照）： 

7 μl   双蒸水 

2 μl  Gel Shift Binding 5×Buffer 

0 μl   蛋白质溶液 

9 μl   总体积

反应 2（正对照）： 

μl  双蒸水 

2 μl  Gel Shift Binding 5×Buffer 

μl  蛋白质溶液 

9 μl   总体积

反应 3（专一性竞争物）： 

μl  双蒸水 

2 μl  Gel Shift Binding 5×Buffer 

μl  蛋白质溶液 

1 μl   未标记的 DNA片断（5­6 pmol） 

9 μl   总体积 

2. 室温放置5­-10分钟， 后在上述每个反应管中分别加1 μl ³²P标记的DNA片断。 

3. 室温放置 20 分钟。 

4. 仅在负对照反应管中加 1 μl 凝胶上样 10×Buffer。在 300伏预电泳 10分钟后，反应产品通过一个 4%的非变性聚丙烯酰胺凝胶分析。

5. 在电泳后，用吸水纸吸去凝胶上多余的溶液，然后，用保鲜膜覆盖，并夹在 X 光片与增感屏之间；­70℃过夜进行放射自显影。

溶液或试剂的配方： 

1. Gel Shift Binding 5×Buffer 

20%    甘油 

5 mM  MgCl₂ 

2.5 mM EDTA 

2.5 mM DTT 

250 mM NaCl 

50 mM Tris­HCl, pH 7.5 

0.25 mg/ml  poly(dI­dC)∙poly(dI­dC) 

2. Gel loading 10×Buffer 

250 mM Tris­HCl, pH 7.5 

0.2% 溴酚兰 

40% 甘油 

3. TBE 10×Buffer (1 升) 

107.80g  Tris 

55g  硼酸 

7.44g disodium EDTA∙2H2O 

4.  4%非变性聚丙烯酰胺凝胶（20 ml） 

TBE 10×Buffer   1.0 ml

2% bisacrylamide  500 μl 

40% acrylamide  2.0 ml 

80% 甘油   625 μl 

双蒸水  15.9 ml 

TEMED  10 μl 

10% 过硫酸铵 150 μl 

二、 表面等离子共振 (Surface Plasmon Resonance) 实验 

1. DNA 探针的制备

合成两条互补的 5’­生物素标记的单链 DNA 片段（PAGE 纯化），并用结合缓冲液（10 mmol/L Tris, 30 mmol/L NaCl, pH 7.6） 配成终浓度为 100 μg/ml的溶液。该 DNA 溶液在 95℃保温 5分钟，然后自然冷却到 37℃以下，即达到了退火的目的。 

2. DNA的偶联 

DNA 溶液在 25℃下流经感应片 SA­5 (Amersham Pharmacia Biotech)，流速为 5 μl/min，注射时间为 10分钟，再用 0.05%的 SDS 冲洗。 

3. DNA结合蛋白质与 DNA 结合的动力学分析

将DNA结合蛋白质用稀释缓冲液 (10 mmol/L Tris，5  mmol/L EDTA，0 .05 mmol/L DTT，50 mmol/L NaCl，1 mmol/L MgCl2，4% Glycerol，pH 7.5) 稀释到实验浓度 (856 nmol/L、5 72 nmol/L、2 86 nmol/L、1 43 nmol/L 及 71.5 nmol/L)。蛋白质溶液以 30 μl/min 的流速流过偶联有 DNA 的感应片。其中，结合时间为 120 秒， 解离时间为 180 秒。再用 0.05% SDS再生，从而得到不同浓度的 E2F1 DNA 结合结构域蛋白质的动力学结合曲线。然后，动力学曲线经 BIA evaluation version 3.1 软件处理后，即可得到 E2F1 DNA 结合结构域与 DNA 的结合常数、解离常数、平衡常数及亲和常数。