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中生网 > 医药行业 > 临床医学 > RT-PCR引物设计与是否跨内含子的检测方法(图)

RT-PCR引物设计与是否跨内含子的检测方法(图)

更新:2010年09月20日 阅读次数: 【字体:

问题一:如何在pubmed上找到目标基因的DNA序列以及其内含子和外显子情况。

步骤:打开NCBI主页面,选GENE,输入基因名称-》显示出很多不同种但名字相同的基因(fig.1)-》找到你要的种属,打开-》显示基因信息,找到”Genomic regions, transcripts, and products”,点击基因名称,links到geneback(fig.2)-》显示了该基因DNA的信息(fig.3),可以看到这是基因组DNA,从mRNA选项中可以看到JION后面的是外显子的位置,该基因一个共有3个内含子,4个外显子,以及外显子的起至位置,为了以后的操作,可以把这个DNA序列和外显子的起至位置记下来。

Fig.1

RT-PCR引物设计与是否跨内含子的检测方法(图)

Fig.2

RT-PCR引物设计与是否跨内含子的检测方法(图)

Fig.3

RT-PCR引物设计与是否跨内含子的检测方法(图)

问题二:如何在pubmed上找到目标基因的mRNA序列。

步骤:打开NCBI主页面,选GENE,输入基因名称-》显示出很多不同种但名字相同的基因-》找到你要的种属,打开-》显示基因信息,找到“mRNA and protein”前面那个NM***********,号码(fig.4),把它记下来(后面的blast要用)并点开-》显示这个基因的mRNA信息(Fig.5),最后的Origin是CDNA序列,把它记下来,一会PRIMER的时候要用。

Fig.4

RT-PCR引物设计与是否跨内含子的检测方法(图)

Fig.5

RT-PCR引物设计与是否跨内含子的检测方法(图)

问题三:如何设计跨内含子的引物(利用primer-blast)

1)打开primer-blast网站:(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

2)将mRNA编号(NM***********)输入序列框中,real time PCR 一般产物长度为80~150bp也可以超一点,但是会影响扩增效率,这样就不能用ddCT法计算了,酌情考虑。温度在55~63和GC含量在40%~60%,两条链不要差太远。

3)会得到若干条引物(fig。6),红条中的黄圈标记的小白色缺口是内含子所在的位置,跨过小缺口就是跨了内含子。根据下面列出的引物具体的温度GC含量之类的再进行选择。

4)将初步选择的引物用PRIMER 5验证引物二聚体,发卡结构等,方法见下个问题“问题四:用PRIMER 5查找已知引物的产物位置”。

Fig.6

RT-PCR引物设计与是否跨内含子的检测方法(图)

问题四:如何利用MRNA序列和DNA序列,用PRIMER 5查找已知引物的产物位置,并确定其是否跨内含子。
1)找到目的引物的DNA序列和MRNA(cdna)序列,以问题三中用primer-blast设计的第8条引物为例。

Fig7

RT-PCR引物设计与是否跨内含子的检测方法(图)

2)打开PRIMER 5,将CDNA序列贴入-》点击primer-》显示primer primer界面-》点击左上方的“S”,再点击EDIT primer -》显示EDIT primer界面,在“5‘-3‘”框中贴入已知的Forward primer,点击as is,显示序列已被贴入-》点击analyze,再点击primer-》显示输入的序列和已知CDNA良好配对,点击OK->显示“primer primer界面” 点击左上方的“A”,再点击EDIT primer -》显示EDIT primer界面,在“3‘-5‘”框中贴入已知的REVERSE primer,点击REVERSE,显示序列已被贴入-》点击analyze,再点击primer-》显示输入的序列和已知CDNA良好配对,点击OK->显示“primer primer界面”->在右上角显示PCR产物的起始和结束位点,得到产物长度为145bp。

Fig.8

RT-PCR引物设计与是否跨内含子的检测方法(图)

3)打开PRIMER 5,将DNA序列贴入-》点击primer-》显示primer primer界面-》点击左上方的“S”,再点击EDIT primer -》显示EDIT primer界面,在“5‘-3‘”框中贴入已知的Forward primer,点击as is,显示序列已被贴入-》点击analyze,再点击primer-》显示输入的序列和已知CDNA良好配对,点击OK->显示“primer primer界面” 点击左上方的“A”,再点击EDIT primer -》显示EDIT primer界面,在“3‘-5‘”框中贴入已知的REVERSE primer,点击REVERSE,显示序列已被贴入-》点击analyze,再点击primer-》显示输入的序列和已知CDNA良好配对,点击OK->显示“primer primer界面”->在右上角显示PCR产物的起始和结束位点。

4)该引物利用DNA做模板产生的产物从95-1374,长度为1280bp,由上可知120-1254(长度1134)是内含子,那么,扣除内含子的产物应该是145bp。

5)所以,这是一条跨内含子的引物。

Fig 9

RT-PCR引物设计与是否跨内含子的检测方法(图)

 

关键词:RT-PCR 引物设计
相关栏目:医药行业 临床医学
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