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中生网 > 医药行业 > 临床医学 > 新方法Western blot同时检测大量样本快48倍

新方法Western blot同时检测大量样本快48倍

更新:2010年02月21日 阅读次数: 【字体:
芝加哥大学癌症生物研究所,本-梅癌症研究中心等处的研究人员发明了一种能同时检测大量蛋白的新方法,彻底改变目前我们进行癌症和其它疾病蛋白表达水平检测的技术面貌,这种新方法效果与传统的Western Blotting一样好,但是时间可以大大缩短,比传统Western Blotting快48倍。这一研究成果公布在《Nature Methods》杂志上。

这种称为“micro-western arrays”(微印迹分析)的方法能将蛋白检测常用实验:Western blot的特异识别能力,和DNA芯片检测的高通量能力结合起来,帮助科学家们一次实验就可以观测到细胞中各种蛋白之间的网络系统,节省了每次反复实验的人力和物力。

领导这一研究的芝加哥大学癌症生物研究所资深研究员Richard B. Jones表示,“蛋白才是细胞中真正的行使功能的‘仪器’,但是由于这一系统太复杂,所以还没有科学家能深度剖析它们,现在我们终于能利用这一技术分析蛋白了。”

自上个世纪70年代以来,实验室就开始利用Western blot方法来检测蛋白,这种方法又称为免疫印迹,是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测,对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。Western blot方法由于蛋白是以非共价键形式吸附在固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,因此能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变,从而被广泛的用于检测蛋白水平的表达。

这一方法导致了细胞生物学领域大量成果的涌现,但是仍然受限于WB实验需要大量细胞原料和昂贵的抗体,而且这一方法也不能同时进行多个蛋白的检测。随着细胞网络中成百上千的蛋白被发现,科学家们越来越希望能分析这些蛋白的活动,和蛋白之间的相互作用。

正如Jones博士说的那样,“当你走进一间黑暗的房间,如果不能获得许多信息,那么很难去预测将会发生什么”,“如果有人点亮了灯,那么我们就不会再磕碰到物体了。”

Micro-western arrays(MWA)技术就是这样的一盏灯,这种方法将芯片技术这种单个实验就能检测出上千基因的工具运用到蛋白上,利用预制的micro-western胶(包含96个微胶(miniature,生物通译)),帮助科学家们同时比较数以百计的蛋白表达,或者一次性比较不同治疗条件下蛋白的情况。而且这种方法只需要纳升级细胞原料和抗体,减少了实验成本,也最大化了单个样品实验能获得的信息。

这种MWA方法具体步骤见下图,研究人员为了能结合微型Western Blots方法和微孔板液体操作方法,首先通过一种96孔板大小的96块统一的非接触芯片胶来预印细胞裂解物,这样6中不同的细胞裂解物也许就能通过96个不同的抗体进行检测,或者24个不同的裂解物通过24个不同的抗体进行检测。为了增加大分子蛋白的转膜率,以及降低小分子蛋白的转膜率,研究人员使用了醋酸盐缓冲液来跑胶。每个蛋白点,每次在胶统一位置加6nl样品,反复10次,这比一次放置60nl,蛋白点密度更大,信号更好。在印迹上样品后,研究人员将这些样品进行半干式蛋白电泳(semidry electrophoresis),12分钟后转至NC膜,进行扫描检测。

新方法Western blot同时检测大量样本快48倍

 

这种高通量分析技术,结合了蛋白芯片分析,将纳升级的样品点在胶上进行电泳,从而可以不同分子量的蛋白进行分离,因此效果与传统的Western Blotting一样好,但是时间可以大大缩短,包含transfer、blocking、washing、2nd antibody需要2天,数据分析约需要2-3天,整个过程大约1周的时间,比传统Western Blotting快48倍。这种新的技术,可以用极少量的样品和抗体分析大量数目不同蛋白的变化,极适合研究干细胞、癌细胞、组织发育等过程中信号传导路径(signaling transduction pathway)的变化。

关键词:Western blot
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