寡核苷酸芯片的主要原理与cDNA芯片类似，主要通过碱基互补配对原则进行杂交，来检测对应片段是否存在、存在量的多少。它与cDNA芯片的本质差别在于寡聚核苷酸芯片固定的探针为特定的DNA寡聚核苷酸片段（探针），而后者为cDNA。基因表达芯片的两个重要参数是检测的灵敏度和特异性。cDNA芯片由于基因长短不同以至Tm值各异，众多的基因在同一张芯片上杂交，使得杂交条件很难同一，使得传统的cDNA芯片的分辨能力受到限制。寡聚核苷酸芯片序列选择经过优化，利用合成的一定长度（如20，30，70-mer等）的寡核苷酸单链探针代替全长cDNA点样，制成芯片。其优点：无需扩增，防止扩增失败影响实验；减少非特异杂交，能有效区分有同源序列的基因；杂交温度均一，提高杂交效率；减少二级结构。此外，寡核苷酸芯片还可以通过原位合成法制备，而cDNA芯片只能通过后者制备。上述特点使得寡核苷酸芯片的应用日益广泛。但是当寡核苷酸序列较短时，单一的序列不足以代表整个基因，需要用多段序列。
高密度的寡核苷酸芯片作为一个有力的工具广泛用于分析基因组数据，与传统的凝胶分析方法比较起来，具有成本低、高通量、高度自动化的优点，这些寡核苷酸芯片，已广泛用于用遗传变异扫描、分子条编码、基因表达检测及测序。寡核苷酸芯片主要用途包括：
1）临床诊断方面。用于研究人类多基因相关性疾病（如癌症、心血管疾病等），发现相关的基因及其相互作用机理，寻找早期发现，早期诊断的方法；同时还可制成外源性病原体相关基因芯片，如病毒性肝炎芯片等；
2）基因功能研究。应用基因芯片可以开展DNA测序、基因表达检测、基因突变性、基因功能研究、寻找新基因、单核苷酸多态性（SNP）测定等研究；
3）药物筛选和新药开发。采用了基因芯片技术来寻找药物靶标，查检药物的毒性或副作用，用芯片作大规模的筛选研究可以省略大量的动物试验，缩短药物筛选所用时间，在基因组药学（pharmacogenomics）领域带动新药的研究和开发；并可指导实现合理用药。
4）环境监测和指导高科技农业等。监测流行病和传染病扩散；监测有害微生物的发生和传播；农、林、牧、渔等产业的品种改良和病虫防治。
5）其它。如DNA身份认定等。
